INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (0)

Tallinna Tehnikaülikool
TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö 3.1
INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk
Tallinn 2013

Sisukord

Sissejuhatus 4
Teoreetiline osa 5
Töö käik 6
Töölahuse valmistamine 6
Sahharoosi hüdrolüüs 6
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine 6
Tiitrimistulemused 7
Aktiivsuse arvutamine 9
10
Kasutatud kirjandus 11

Sissejuhatus

Kuuenda praktikumi (22. aprill 2013) teemaks oli invertaasi aktiivsuse määramine. Invertaas on ensüüm, mis katalüüsib O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi β-D-fruktofuranosiidides.
Katses oli kasutusel tahke invertaas.
Järgnevalt on toodud töö teoreetiline osa ning seejärel töö käik, katseandmed ja järeldused.

Teoreetiline osa

Invertaas on ensüüm, mis katalüüsib O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Ensüüm katalüüsib β‑D‑fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist otsmisi fruktoosi molekule. Inimese jaoks on invertaas oluline seedeensüüm (sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskestal). Samuti kasutatakse meie töös substraadina sahharoosi, mille hüdrolüüsiproduktideks on glükoos ja fruktoos .
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.
Töös leiab kasutamist kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon-B kompleksi. Reaktiiv lõpetab ensüümireaktsiooni ja tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena eralduv Cu2O . Reaktsioonil vabaneb vaba triloon-B, mille kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus.
Invertaasi aktiivsus tahke ensüümi puhul avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta. 1 mikrokatal on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 °C juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (meie töös taandavat suhkrut).

Töö käik

Töölahuse valmistamine

Kasutan töölahuse valmistamiseks tahket invertaasi. Vajan töölahust kontsentratsiooniga 2 mg/ml. 5 ml töölahuse valmistamiseks vajan seega 10 mg ehk 0,01 g invertaasi. Kaalun ensüümi analüütilisel kaalul ; invertaasi kaalutiseks on 0,0103 g. Viin invertaasi ilma kadudeta gradueeritud katseklaasi mahuga 10 ml. Lisan ensüümile 5 ml (mõõtmine toimub silma järgi) atsetaatpuhvrit p p pH väärtusega 4,8. Segan katseklaasi sisu hoolikalt viie minuti vältel klaaspulgaga. Tulemuseks on hägune invertaasi lahus.

Sahharoosi hüdrolüüs

Töös on substraadina kasutusel sahharoosi 7%-line lahus puhvris (atsetaatpuhver pH väärtusega 4,8). 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml sahharoosi lahust. Katseklaas varustatakse korigiga ja asetatakse vesitermostaati kümneks minutiks 30 °C juurde soojenema.
Samal ajal võetakse kolm 250 ml koonilist kolbi. Igasse pipeteeritakse 10 ml sinise värvusega komplekslahust. Meie töös on kasutusel tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)‑triloon B kompleksi.
Kui sahharoos on 10 minutit soojenenud, võetakse katseklaas termostaadist välja, lisatakse sellele kiirelt 1 ml invertaasi töölahust, loksutatakse (samal ajal fikseeritakse ensüümireaktsiooni algus). Kohe pärast loksutamist pipeteeritakse esimesse koonilisse kolbi (kolvid on nummerdatud) 1 ml reaktsioonisegu ( substraat + invertaasi töölahus). Seega on esimeses kolvis 0- proov . Selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. Reaktsioonisegu asetatakse kohe termostaati tagasi.
10 minutit pärast ensüümireaktsiooni algust pipeteritakse uuesti 1 ml reaktsioonisegu ja lisatakse see teise komplekslahust sisaldavasse koonilisse kolbi. Kolmandasse kolbi toimub pipeteerimine ensüümireaktsiooni 20. minutil.
Kui kolme kolbi on reaktsioonisegu lisatud, võetakse reaktsiooniseguga katseklaas termostaadist välja.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine

Cu2O formeerumine toimub keemistemperatuuril. Selleks asetatakse kolvid elektripliidile püstjahuti alla. Alates keemise algusest keedetakse kolvide sisu 10 minutit. Pärast seda lisatakse jahuti otsast keemisprotsessi lõpetamiseks igasse kolvi 150 ml destilleeritud vett. Kuumad kolvid võetakse pliidilt ja jahutatakse voolava kraanivee all. Jälgitakse, et kolvidesse ei pritsiks kraanivett, sest see rikub töö tulemuse (triloon-B komplekseerub kraanivees leiduvate metallidega).
Pärast keetmist on esimeses, 0-prooviga kolvis sinine lahus. Teises kolvis on tumesinises lahuses veidi punast sadet. Kolmandas kolvis on punane Cu2O sade kõige märgatavam.
Igasse kolvi lisatakse 0,2 ml ehk 200 μl indikaatori mureksiidi vesilahust (automaatpipetiga). Kõikides kolvides omandavad lahused kerge violetse tooni. Seejärel toimub tiitrimine .
Tiitrimiseks kasutatakse 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitritakse, kuni kolvide sisu omandab püsiva roheka värvuse. Esimeses kolvis sain mererohelise värvuse. Tiitrisin veidi üle, seega lahutan mõõdetud 1,8 ml mahust ühe tilga mahu (0,025 ml). Teises kolvis kulus tiitrimiseks suurem hulk, samuti lahutan ühe tilga, mille lisasin püsiva värvuse kontrollimiseks (mõõdetud maht 10,1 ml). Kolmandas kolvis ei täheldanud kohe värvuse muutust ja lahutan mõõdetud 25,9 mahust 2 tilka.

Tiitrimistulemused

Kolb
Büreti näit
CuSO4 maht
Kontsentratsioon
1 (0-proov)
1,8 ml
1,8 – 0,025 = 1,775 ml
1,57 mg/ml
2 (Δt = 600 s)
10,1 ml
10,1 – 1,8 – 0,025 =
= 8,275 ml
7,30 mg/ml
3 (Δt = 1200 s)
25,9 ml
25,9 – 10,1 – 0,05 =
= 15,75 ml
13,89 mg/ml
Kuna tilga mahu vale suuruse tõttu muutuvad kõik tiitrimismahud, koostan varem vaadatud tulemuste põhjal kaliibrimissirge, millelt saan vaadata õiged kontsentratsioonid.

Aktiivsuse arvutamine

Invertaasi aktiivsus arvutatakse järgmise valemi järgi:
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis (1,55 mg/ml)
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis (7,1 mg/ml või 13,5 mg/ml)
V1 – reaktsioonisegu üldmaht (25 + 1 = 26 ml)
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht (5 ml)
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus (600 s või 1200 s)
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks (1 ml)
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht (1 ml)
G – ensüümipreparaadi kaalutis (0,0103 g)
Kahe arvutuse vahe protsentides on 50,25 / 669,63 = 7,5% ja see jääb lubatud 20% piiridesse .
Arvutan kahe tulemuse keskmise, mis ongi invertaasi aktiivsus.
Invertaasi aktiivsus on 694,755 μkat/g.
Järeldused
Oma katse tulemusel leidsin, et invertaasi aktiivsus on 694,755 μkat/g. See tähendab, et üks gramm invertaasi produtseerib 694,755 mikromooli taandavat suhkrut 1 sekundi jooksul 30 °C juures. Kahjuks ei leidnud kirjandusest invertaasi aktiivsuse kohta sobilikke materjale, seega ei saa oma tulemust millegagi võrrelda.
Tegelikkuses oleks võinud kahe aktiivsuse vahe olla väiksem, mistõttu ei saa oma katset täiesti õnnestunuks lugeda. Sellegi poolest oli aktiivsuste vahe piisavalt väike, et arvutada nende keskmist.

Kasutatud kirjandus

Malle Kreen , Terje Robal , Tiina Randla „Biokeemia laboratoorsed tööd“ , Tallinn 2010