Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Liina Reimann
134537KATB
Invertaas ehk β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk β-fruktofuranosidaas on ensüüm , mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis, hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule.
Invertaas
β-D-fruktofuranosiid + H2O → β, D- fruktoos + mono - või oligosahhariid
Looduses on kõige levinumaks β-D-fruktofuranosiidiks sahharoos . Sahharoosi hüdrolüüsi produktideks on β-D-fruktoos ja α-D- glükoos . Invertaasi produtseerivad pärmid , hallitusseened, paljud taimed, mesilased . Inimese jaoks on invertaas oluline peensoole limaskesta rakkude poolt toodetav seedeensüüm, sest selle toimel hüdrolüüsub organismis sahharoos.
Sahharoosi kasutatakse ka invertaasi aktiivsuse määramisel, mis põhineb sahharoosi hüdrolüüsil vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.
Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks .
Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov . Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade.
Keetmisel toimub järgnev reaktisoon:
Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust. Lahusesse lisatakse ka indikaatorina mureksiidi, mis muudab värvi triloon B ja Cu(II)-ioonide kompleksi taastekkimisel.
Suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrmiseks kulunud CuSO4 hulga järgi kaliibrimissirgelt. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites: vedela ensüümipreparaadi korral μkat/ml, tahke preparaadi puhul μkat/g.
Tiitrimisel toimub järgnev reaktsioon :

Töö käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

Valmistan vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Mõõdan automaatpipetiga 1 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9 ml atsetaatpuhvrit.
Alglahus: 0,2 ml, 50 x lahjendus  kokku 10 ml
Sulen katseklaasi korgiga, lahust loksutan kontsentratsiooni ühtlustamiseks.

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüs) läbiviimine

Pipeteerisin 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 ( substraat ). Sulgesin katseklaasi korgiga ning asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema 10 minutiks.
Pipeteerisin kolme 250 ml-sse koonilisse kolbi 10 ml komplekslahust.
Kui substraat oli saavutanud termostaadis temperatuuri 30°C, lisasin sinna 1 ml invertaasi töölahust, loksutasin ning võtsin sellest reaktsioonisegust 1 ml lahust ja viisin ühte komplekslahusega kolbi (0- proov ). Seejärel asetasin katseklaasi tagasi termostaati.
10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin reaktsioonisegust 1 ml lahust ning viisin teise komplekslahusega kolbi.
20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ning viisin selle kolmandasse kolbi.

Reaktsiooniproduktuide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Asetasin komplekslahuse ja reaktsioonisegust võetud proovidega kolvid elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema . 10 minuti pärast valasin kolbidesse läbi püstjahuti 150 ml destilleeritud vett. Teises ja kolmandas kolvis tekkis keetmisel lahusesse punane Cu2O sade. Võtsin kolvi pliidilt ning jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
Lisasin kõikidesse kolbidesse indikaatorina 6 tilka mureksiidi vesilahust, mis andis kolvis olevale helesinisele tumedama sinise värvuse (kolmandas kolvis violetse).
Tiitrisin lahuseid pidevalt loksutades 0,02M CuSO4 lahusega roheka värvuse tekkimiseni.
Tiitrimistulemused:

V(CuSO4)= 2,2 ml

V(CuSO4)= 11,3 ml

V(CuSO4)= 18,5 ml
Kaliibrimisgraafikult vaadatud taandavate suhkrute sisaldus:

C=2,0 mg/ml

C=10,0 mg/ml

C=18,0 mg/ml
Arvutatud aktiivsused:
kus:
C₁ - taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
C₂ - taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
V₁- reaktaioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml
V₂ - ensüümi töölahuse üldmaht, ml
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi molekulmass
V₃ - proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V₄ - ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
L – lahjendusmäär
A₁₀ ja A₂₀ peaksid teineteisest erinema maksimaalselt 20% võrra, minu tulemuste erinevus jääb lubatud piiri. Katseviga võis tekkida invertaasi lahuse valmistamise käigus ning lahuste täpsete koguste pipeteerimisel.