Invertaasi aktiivsuse maaramine (0)

Töö 3.1
INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Marilin Karu
142627YAGB22
Juhendaja : Malle Kreen

Töö teoreetilised alused

Invertaas on ensüüm , mis kuulub glükosidaaside (katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi) hulka. Invertaas katalüüsib süsivesikute, mis sisaldavad fruktoosi molekule, hüdrolüüsireaktsioone, vabaneb fruktoosi molekul . Kõige sagedamini esineb sellistest süsivesikutest looduses sahharoosi, mille hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on E-D-fruktoos ja α-D- glükoos . Seega kasutatakse enamasti invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel substraadina just sahharoosi.
Sahharoos -> glükoos + fruktoos
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määrmaisel reaktsioonisegus.
Glükoosi ja fruktoosi koguse määramiseks võetakse põhireaktiiviks tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub vask ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille kogus määratakse tiitrimisega , kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ja indikaatorit mureksiidi.
Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon (kaliibrimissirgelt).

Töö käik

Kasutati tahket invertaasi, mida kaaluti 0,01g ja millele lisati 5ml atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Seda segati klaaspulgaga 5 minutit.
50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 7%-list sahharoosilahust atsetaatpuhvris (pH=4,8) ja katseklaas asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10ks minutiks.
Samal ajal valmistati ette kolm 250ml koonilist kolbi, pipeteerides sinna 10ml komplekslahust.
Kui substraat termostaadis 10 minutit oli olnud, võeti see välja, lisati sellele 1ml invertaasi töölahust, loksutati katseklaasi, fikseeriti ensüümireaktsiooni algusaeg , võeti sealt kuiva pipetiga 1ml lahust ja asetati katseklaasi tagasi termostaati. Pipett tühjendati esimesse komplekslahusega kolbi. See oli 0- proov .
10 minuti pärast võeti sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja viidi teise kolbi, katseklaas asetati tagasi termostaati, kust see järgmise 10 minuti pärast taas võeti, et ka kolmandasse kolbi 1ml reaktsioonisegu viia.
Esimesed kaks kolbi pandi elektripliidile püstjahutite alla. Kui need keema hakkasid, fikseeriti aeg ja 10 minuti pärast valati neisse 150ml destilleeritud vett. Sellega lõpetatakse keemine. Kolvid jahutati kraanivee all toatemperatuurini.
Keetmisel muutus II kolb (10min proov) sinisest roheliseks ja märgata võis punast sadet, mida I kolvis (0-proov) polnud.
Siis pandi pliidile ka kolmas kolb (20min proov) ja lasti samamoodi 10 minutit keeda. Keemise ajal oli märgata rohkem sadet kui teises kolvis. Ka see jahutati kraanivee all toatemperatuurini.
Kõikidesse kolbidesse pipeteeriti 0,3ml mureksiidi vesilahust indikaatoriks, see andis lahusele violetse tooni.
Tiitrimine viidi läbi 0,02M CuSO4 lahusega, tiitriti kuni violetne värvus asendus püsiva rohelise värvusega.
Tulemused:
I kolb 1,9ml
II kolb 2,0ml
III kolb 9,2ml
Glükoosi sisaldumine leiti kaliibrimisgraafikult:
I kolb 1,8mg/ml
II kolb 5mg/ml
III kolb 8,2mg/ml
Invertaasi preparaadi aktiivsus arvutatakse:
A = (C2 – C1) • V1 V2 • 103 / (T • 180 • V3 • V4 • g)
C1 =1,8mg/ml
C2 =5mg/ml ja 8,2mg/ml
V1 =25ml
V2 =5ml
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T =600s ja 1200s
180 – glükoosi molekulmass
V3 =1ml
V4 =1ml
G =0,01g
A1=370,4 µkat/g
A2=370,47 µkat/g

Kokkuvõte

Invertaasi preparaadi aktiivsus oli 370,43 µkat/g. Ühik kat/g tähendab, et 1 sekundi jooksul 1g alkalaasi katalüüsib 1mol kaseiini . Kuna A1 ja A2 arvutused andsid sarnase tulemuse, olid mõõtmistulemused õiged ja üsnagi täpsed.