Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Biokeemia
Laboratoorne töö nr:
3.1 nr?
Töö pealkiri: Invertaasi aktiivsuse määramine. See on teema! Töö nimetus?
Juhendaja :
Malle Kreen
Töö teostaja: Erki Aun
Õpperühm:
YAGB21
Üliõpilaskood:
112262
Palun parandada ja täiendada. 09.04. M.K.
3. Biokatalüüs
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine

• Töö teoreetilised alused
  

Töö eesmärk oli määrata invertaasi aktiivsus. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhines sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.
Kasutasin kvantitatiivset meetodit – tiitrimist. Antud töös leidis kasutamist nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiv sisaldas vask(II)-triloon B kompleksi ja oli tugevalt aluselise reaktsiooniga. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavate suhkrutega proovi viisin komplekslahusesse. Seal olev vask(II)-triloon B kompleks laguneb reaktsioonil suhrutega ning lahusesse jääb vaba triloon B.
Järgnes vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon – B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsiooni reaktsioonisegus.
Kõigepealt valmistasin invertaasi lahuse, et hakata määrama seal oleva invertaasi aktiivsust. Selleks mõõtsin vajalikud kogused ja mahud ning et töö tulemus oleks täpne tegutsesin kvantitatiivselt. Seejärel segasin, et moodustuks ühtlane suspensioon. Vedela ensüümpreparaadi doseerisin sobiva pipeti abil.
Seejärel valasin katseklaasi reaktsioonisegu ja panin ta vesitermostaati juurde soojenema reaktsiooni soodustamiseks ning 3 koonilisse kolbi komplekslahuse, et need kindlatel aegadel kokku viia. Kokkuviimise hetkel fikseerisin aja, et lahused reageeriksid kindla aja. Kohe pärast reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sealt 0-proovi, mis iseloomustab sahharoosi hüdrolüüsi alghetkel . 10 minuti möödudes võtsin järgmise proovi, et teha kindlaks hüdrolüüs 10 min möödudes. 20 minuti möödudes võtsin viimase proovi, et teha kindlaks hüdrolüüsi ulatus 20 min möödudes.
Seejärel alustasin taandavate suhkrute reageerima panemist vask(II) – triloon B kompleksiga. Selleks ajasin kolvid 10-ks minutiks keema , sest reaktsioon toimub keemistemperatuuril. Pärast 10-t minutit keemist valasin 150 ml destilleeritud vett kolbi läbi püsijahuti, et suureneks vedeliku maht kolvis ning indikaatori värvuse paremini märgatavaks muutmiseks tiitrimisel. Seejärel lisasin kolvidesse mureksiidi vesilahust indikaatoriks tiitrimisel. Seejärel viisin CuSO4 lahusega läbi tiitrimise, et kasutatud titrandi mahu järgi määrata hüdrolüüsunud suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegus võetud proovis. Seda kasutades saan arvutada ensüümi preparaadi aktiivsuse.

• Töö käik etappide kaupa
  

Ensüümpreparaadi töölahuse valmistamine
Praktikumi juhendaja näpunäidete järgi valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümi kontsentratsiooniga lahust (nn töölahust). Lahustina kasutasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Vedelat invertaasi lahust lahjendasin puhvriga 50 korda, ehk pipeteerisin automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi 0,2 ml invertaasi lahust ja seejärel täitsin katseklaasi kuni 10 ml-ni puhverlahusega. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks.
Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine
Kõigepealt võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH-väärtusega 4,8. Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1oC juurde soojenema. Seejärel võtsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viisin reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldust. Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30oC, lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, lahuse loksutasin läbi ja katseklaasi asetasin kiiresti termostaati tagasi. Samal ajal käivitasin stopperi, et mõõta ensüümreaktsiooniks kulunud aega. Kohe pärast reaktsioonisegu läbiloksutamist võtsin sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. See oli nn 0- proov , kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel ja proovi võtmine peab toimuma seetõttu võimalikult kiiresti. 10 minutit pärast ensüümreaktsiooni algust võtsin sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viisin teise komplekslahust sisaldavasse kolbi. 20 minutit pärast ensüümreaktsiooni algust võtsin veel 1 ml reaktsioonisegu ja viisin kolmandasse kolbi. Seejärel eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Kolvid koos komplekslahuse ja erineval aegadel reaktsioonisegust võetud proovidega asetasin elektripliidile püstjahutite alla 10-ks minutiks keema. 10 minuti pärast lõpetasin keetmise 150 ml destilleeritud vee (mõõdetakse mõõtsilindriga) valamisega kolbi läbi püstjahuti. Sellega suurenes ühtlasi vedeliku maht kolvis ja indikaatori värvuse muutus kolvis muutus paremini märgatavaks. Kolvi võtsin pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini. Kõikidesse kolbidesse lisasin indikaatorina 0,15 ml mureksiidi vesilahust, mis andis kolvis olevale lahusele violetse tooni. Kolbides olevate lahuste tiitrimise viisin läbi 0,02 M CuSO4 lahusega kuni violetne värvus asendus selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Tiitrimise käigus loksutasin kolvi sisu pidevalt. Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafiku (sirge) järgi taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Seejärel arvutasin valemi järgi invertaasi aktiivsuse (A) µkat/g.

• Tulemuste analüüs ja kokkuvõte või järeldus tööst
  

Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 hulkade järgi kaliibrimisgraafikult leitud taandavate suhkrute sisaldused reaktsioonisegus.
V (CuSO4) Glükoosi sisaldus mg/ml
3,8 3,4
9,3 8,2
14,5 12,4
Vedela invertaasi preparaadi uurimisel avaldatakse aktiivsus ensüümipreparaadi 1 ml kohta (µkat/ml). Arvutus viiakse läbi vastavalt valemile:
A = (C2-C1)*V1*L*103/T*180*V3*V4,
kus:
C1 – taandavate suhrute sisaldus 0-proovis, mg/ml,
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T, mg/ml,
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml,
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele,
T - hüdrolüüsi kestus, s,
180 – glükoosi molekulmass,
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks , ml,
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml,
L – lahjendusmäär, mida kasutasin vedelast ensüümpreparaadist töölahuse valmistamisel.
(A10 min=(8,2-3,4)*26*(1/50)*103/600*180*1*1=0,023 µkat/ml)
(A20 min=(14,5-3,4)*26*(1/50)*103/1200*180*1*1=0,027 µkat/ml Arvutusvead!)
A10 min=(8,2-3,4)*26*50*103/600*180*1*1=57,8 µkat/ml
A20 min=(14,5-3,4)*26*50*103/1200*180*1*1=66,8 µkat/ml
Invertaasi aktiivsuse avaldan kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena. (A=(0,023+0,027)/2=0,025 µkat/ml)
A=(57,8+66,8)/2=62,3 µkat/ml
Invertaasi aktiivsus on katsetulemuste kohaselt 62,3 µkat/ml. 10-ndal ja 20-ndal minutil võetud reatsioonisegudest arvutatud aktiivsused erinesid teineteisest vähem, kui 20% võrra, mis kirjanduse alusel näitab, et töö on läbi viidud korrektselt.
Mida määratud aktiivsus sisuliselt väljendab?
Minu katsetulemuste keskmine 62,3 µkat/ml väljandab uuritava invertaasi suutlikkust toota ühe sekundi jooksul 30O C juures 62,3 µmol-i produkti , milleks oli taandav suhkur.