Invertaasi aktiivuse määramine. (0)

Biokeeemia laboritöö No 5
Invertaasi aktiivuse määramine.
Õpperühm: YAGB21
Töö teostaja : Alexander Kirichuk
Õppejõud: Tiina Randla
Õppejõu märkused: Invertaas - taas tulemuste analüüs! Antud juhul võiks jälle keskenduda töökultuurile, analüüsida, kas 10 ja 20 min reaktsiooni aktiivsused on piisavalt sarnased. Kui ei, siis miks?
Teoreetiline osa!

• Invertaas (β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas) – ensüüm, mis kuulub glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O- glükosiidsideme hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastadesneist fruktoosi molekule.
  
• Saharoos – kõige levinum looduses β-D- fruktofuranosiid . Hüdrolüüsi produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos.
  
• Invertaas on väga oluline inimese seedeensüüm. Saharoos hüdrolüüsib peensoole limaskesta rakkude poolt doodetava invertasi toimel.
  

• Invertaasi aktiivsuse määramise meetod sahharoosi(mittetaandav suhkur) hüdrolüüsi uuritava invertaasipreparaadi timel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus.
  
• Hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide koguse kindlakstegemiseks kasutatakse erinevaid meetodid.
  

Meie töös me kasutame kompleksomeetrilist meetod. Põhireaktiiviks on aluseline lahus , mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleks. Reaktiiv täidab 2 rolli: 1) tänu aluselisele keskonnale inaktiveerib ta invertaasi, 2) tagab taandavate suhkrute määramiseks vajalikuleeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi

• Tindlal ajahetkel võetud proov viiakse komplekslahusse. Keemistemperaturil Cu- ioonid moodustavad Cu2O , nis eraldub punase sademena. Lahuses jääb aga triloon-B(ekvivalentses koguses).
  

Järgmisel etapil tiitrimise teel määratakse vabastanud Triloon B koguse. Tiitrimiseks kasutatakse 0,02M vasksulfiidi lahust. Cu(II ) ioonid reageeruvad Triloon B-ga ja tekkib uuesti vask(II)-triloon B kompleks, indikatori värvuse muutumise kaasnemisel.

• Tiitrimiseks kuulunud CuSO4 koguse järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsiooni reaktsioonisegus.
  
• Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites (µkat) grammi või ml(vedela preparaati juhul) kohta.
  

1 µkat - ensüümi aktiivsuse ühikuks, mis peegeldab 1 µmooli produktide tekkemist 1 sekundi jooksul 30◦C juures.
Töö käik.!

• Ensüümipreparaadist töölahust valmistamine:
  

Lahustina kasutatakse atsetaatphuvrit(pH=4,8). Meie juhul preparaat on tahke. Siis sobiv ensüümi kontsentratsioon 1-5 mg/ml.(me võtame aga 3 mg/ml) . Siis 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 15 mg ensüümi). Paneme gradueeritud katseklaasi 15mg enne kaalutatud preparaadi ja lisame puhverlahust 5ml kriipsuni.Segame 5 minuti.
Ensüümi reaktsiooni läbiviimine:

• Võtme suur 50 ml katseklaas kuhu pipeteerimie 25 ml substraati(7%line saharoosatsetaatpuhvris pH=4.8). Katseklaas asetataske 5-10 minutiks vesitermostaati 30◦C juurde.
  
• Võtame 3 koonilist 250 ml kolbi, kuhu pipiteerimime 10 ml komplekslahust.Pärast kolbidesse viiakse reaktsioonisegust võetud proovid.
  
• Võtame termostaadist 50 ml katseklaas substraadiga ja lisame 1ml ensüümilahust. Loksutame. Kohe võetme reaktsioonisegust 1ml lahust ja lisame esimesse 250 ml kolbi. (See on null proov). Fikseerime aega ja paneme reakstioonisegu tagasi termostaati.
  
• 10ndal ja 20ndal minutitel võtame ka teine ja kolmas proov ja lisame neid 250 kolbidese.
  
• Selle tulemusena mneil on 3 250 ml-list kolbi kus asuvad erineval ajal proovid ja komplekslahus. Komplekslahus neutraliseerib invertaasi.
  

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine.

• Cu(II) ioonide taandavate suhkrute poolt redutseerumine Cu2O-ks ja vaba Triloon B eraldumine toimub keemistemperatuuril, siis asetame 3 250ml-list kolbid elektripliidile püstjahuti alla 10 minutiks keema.
  
• 10 minuti pärast lisame kolbi 150 ml külma vee, mis lõpetab keetmist. Segu jahutame toatemperatuurini.
  
• Iga kolbi lisame indikaatorina 0,3 ml mureksiidi vesilahust, mis annab lahusele violeetse tooni.
  
• Tiitrimine . Tiitrimiseks kasutame 0,02M vasksulfiidi lahust. Tiitrimine jätkatakse kuni violeetne värvus muutub roheliseks.
  
• Tiitrimiseks kuulunud CuS04 lahuse hulga järgi leiame kaliibrimisgraafikut kasutades taandavate suhkrute sisaldus mg/ml.
  
• Leiame invertaasi aktiivuse A (µkat/g). Kasutame antud valemi:
  

A=(C2-C1)* V1* V2 *103/T * 180 *V3 *V4*g
Kus:
C1-taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis.
C2-taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis (mg/ml)
V1-reaktsioonisegu üldmaht (ml)
V2-ensüümi töölahuse üldmaht (ml)
T -hüdrolüüsi ketus (s)
180-glükoosi molekullmass
V3 -proovi maht taandavate suhkrute määramiseks (ml)
V4-ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahusemaht (ml)
g -ensüümiprepraati kaalutis (g)
Töö tulemused! :D
Proovi number
Kuulunud CuSO4 ml
Glyc mg/ml
0 (0 minutil võtnud)
2,3
2
1 (10 minutil)
12,6
11,1
2 (20 minutil)
23,3
18
Leiame invertaasi aktiivsuse(A):
A=(C2-C1)* V1* V2 *103/T * 180 *V3 *V4*g
A1=(11,1-2) * 26*5*103 /600 *180 * 1*1*0,015 =5323,5 µkat/ml
A2=(18-2) * 26* 5*103 /1200 *180 * 1*1*0,015 = 4680 µkat/ml
Akeskmine = (A1+A2)/2 = (5323,5+4680)/2 = 5001,5 µkat/ml
Siis A=5001,5 µkat/g
Kokkuvõte ja tulemuste analüüs.
Antud laboritöös olime käsitlenud invertaasi toime ja selle aktiivsusi määramise meetod. Esimeste 10 minuti jooksul invertaasi aktiivsus oli suurem, kui 10-st 20 minutini. Kõige tõenäolisemaks põhjuseks on substraadi kontsentratsiooni vähendamine, mille tulemusena oli vähenenud ensüümiaktiivsus.