Laboratoorne töö 3.5 (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL3312 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
3. Biokatalüüs
3.5. Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel meetodil.
Tallinn 2010
3. BIOKATALÜÜS
3.5 GLÜKOOSI SISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Glükoosi sisalduse määramiseks kasutatakse meetodit, mis põhineb kahe ensüümi glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel . GODi spetsiifilisus substraadi suhtes annab võimaluse määrata glükoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul. GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. See ensüüm sisaldab endas prosteetilise grupina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koeensüüm. Selle kaasabil kantakse glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit hapnikule. Toimub glükoosi oksüdeerumine glükoonhappeks ja tekib vesinikperoksiid.
Seejärel osaleb POD, katalüüsides spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Peroksiid redutseerub, tekib vesi. Kasutades substraati, mis oksüdeerudes annab värvilise produkti , saab seda jälgida spektrofotomeetriliselt. Antud töös kasutatakse värvilise substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) ehk kollast veresoolt. Reaktsiooni käigus Fe oksüdeerub Fe-ks, sellega kaasneb H2O2 redutseerumine. Tekib punane veresool, mis annab lahusele kollase värvi ja on detekteeritav lainepikkusel 410nm.
TÖÖ KÄIK:
Tundmatuks prooviks oli viinamari , kust uhmerdasin välja umbes 1 ml mahla. Sellest 0,5 ml lahjendasin kolvis 200 ml destilleeritud veega.
Glükoosi lahusest, mis oli saadud õppejõu käest, tegin kolm lahjendust. Esimesse katseklaasi pipteerisin 2,5 ml glükoosilahust ja 7,5 ml vett. Seejärel
võtsin samast katseklaasist 5ml proovi ja lisasin 5ml vett. Kolmandasse katseklaasi võtsin 5ml teisest katseklaasist proovi ja lisasin juurde 5ml vett.
Tööreaktiivi koostis:
Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab:

• 2,5 mg glükoosi oksüdaasi
  
• 1,5 mg peroksüdaasi
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH= 6,0
  
• K-heksatsüanoferraat(II) K4(Fe(CN)6) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini.
  

Seejärel asetasin statiivile kuus puhast katseklaasi ja nummerdasin need. Esimesse panin 1 ml destilleeritd vett ja lisasin juurde 3ml tööreaktiivi. Teise ja kolmandasse panin 1ml viinamarja lahust ja 3ml tööreaktiivi. Neljandasse, viiendasse ja kuuendasse panin 1ml erineva sisaldusega glükoosi lahust, mis eelnevalt said valmis tehtu ja panin juurde kõikidesse 3ml tööreaktiivi. Kõki katseklaase loksutasin hoolikalt kohe pärast tööreaktiivi lisamist ja jätsin naa 20 minutiks seisma. Oli näha väga õrna kollakat värust. Seejärel määrasin spektrofotomeetr abil kõikide lahuste optilised tihedused .
OPTILISED TIHEDUSED:
KATSEKLAAS nr.1: 0,043 ABS
KATSEKLAAS nr.2: 0,081-0,043= 0,038 ABS
KATSEKLAAS nr.3: 0,083-0,043=0,04 ABS
KATSEKLAAS nr.4: 0,131-0,043=0,088 ABS
KATSEKLAAS nr.5: 0,089-0,043=0,046 ABS
KATSEKLAAS nr.6: O,O67-0,043=0,024 ABS
Kaliibrimisgraafik
Paralleelproovide optiliste tiheduste keskmine on 0,038+0,04/2=0,039. Kaliibrimisgraafiku järgi on viinamarjamahla lahuse kontsentratsioon 0,15mg/ml. Lahjendustegur on 400.
Algmahla kontsentratsioon on siis 400*0,15= 60 mg/ml
Naturaalses mahlas on 60mg/ml glükoosi. 1 ml mahla on 1g mahla, ehk 1000mg mahla. Järelikult:
1000mg 100%
= 60*100/1000=6%
60mg x%
Kokkuvõte: Tegelikult peaksid viinamarjad sisaldama umbes 7% glükoosi, mis on ligilähedane selle, mis mina sain. Glükoosisisaldus oleneb viinamarjade küpsusest ja katseks võetud ainete mahu täpsusest.