Invertaasi aktiivsuse määramine (6)

YKL3312 Biokeemia - praktikum
Laboratoorse töö
nr ja pealkiri
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Õpperühm:
Töö teostaja:
Matriklinumber :
Teoreerilied alused.
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib β, D – fruktofuranoosiide hüdrolüüsi:
β, D – fruktofuranoosiide + H2O → alkohol + fruktoos
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos . Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, aga ka paljud taimed.
Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisele uuuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisele reaktsioonisegus.
Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel.
Glükoosi ja fruktoosi koguse kinladktegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiiv – tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II) – triloon B konpleksi. Leeliseline komplekslahus toimib invertaasile inaktiveerivalt (kuna invertaasile on vaja happelist keskkonda) ja lõpetab reaktsiooni.
Pärast hüdrolüüsireaktsiooni võetakse taandavaid suhkruid ja keedetakse segu komplekslahusega, mille tulemusena moodustub punane sade Cu2O ja ekvivalentses koguses vaba triloon.
Triloon B tiitritakse 0,02M vasksulfaadi lahusega (indikaatorina mureksiidi vesilahus ).
Invertaasi aktiivsus määratakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta.
Tiitrimiseks kulunud 0,02M CuSO4 lahuse hulga järgileitakse taandavate suhkrutesisaldus proovis Invertaasi aktivsuse leitakse kasutades valemi:
kus:
C1 – taandavate suhkrute sisaldus aja hetkel T võetud proovis, mg
C2 – taandavate suhkrute sialduse 0 – proovis, mg
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht, ml
1000 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi moolmass
V2 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V3 – uurimiseks võetud invertaais lahuse maht, ml.
Töö käik.

100 ml koonilisse kolbi pipeteeritakse 25 ml 7%- list sahharoosi lahust, mille ph on 4,8 (reguleeritud atsetaatpuhvri abil). Lahus asetatakse vesitermostaati 30ºC juurde soojenema (5-10 min). Tehakse ka uuritav invertaasi lahus. selleks kaalutakse 0,0208 g tahket invertaasi ja lahustatakse seda atsetaatpuhvris 5 ml-ni (pH = 4,8).

Kolme koonilisse kolbi mahuga 250-300 ml pipeteeritakse 10 ml komplekslahust.

5-10 min. pärast sahharoosi lahusele lisatakse 0,5 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja käivitatakse stokker või fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi.

Kohe peale ensüümi lisamist võetakse 1 ml hüdrolüüsisegu ja viiakse ühte koöbidest, kus on komplekslahus. Selles määratav taandaavate suhkrute sisaldus iseloomustab 0-proovi. 10 min- peale ensüümi lisamist pipeteeritakse 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ja siis 20 min. pärast kolmandasse kolbi.

Kolvid reaktsiooniseguga asetatakse 10 minutiks elektripliidile püstjahuti alla keema . Keemistemperatuuril toimub vase redutseerimine . Keetmine lõpetatakse ymbes 150 ml dest. vee lisamisega kolbi läbi püstjahuti. Kolb võetakse pliidilt ja jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini.

Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M CuSO4 lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimist lisatakse igasse kolbi 0,3 ml mureksiidi lahust. Kolvi sisu värvub violetseks. Tiitritakse seni, kuni kolvi sisu muutub samblaroheliseks.
Kaste tulemused.
V(CuSo4), ml
C (mg/ml)
Aktiivsus (μkat/g)
0- proov
0,5
0,45
1-proov
7,8
6,95
723 μkat/g
2-proov
13,8
11,4
609 μkat/g
A1 = (6,95 – 0,45)*25*1000*5 / 600*180*1*0,5*0,0208 = 723 μkat/g
A2 = (11,4 – 0,45)*25*1000*5 / 1200*180*1*0,5*0,0208 = 609 μkat/g
Järeldus.
Tulemus näitab, et katse oli tehtud mitte päris täpselt, mille tõttu sain suurt erinevust aktiivsuste vahel. Võib olla viga oli tehtud kas invertaasi lahuse tegemise käigus või tiitrimise käigus või reagentide kogused ei olnud eriti täpsed.
Nii kui nii saadud tulemus tähendab,et 1 g invertaasi kutsub esile 609-723 mikromooli sahharoosi hüdrolüüsi 1 sekundi jooksul.