Glükoosi määramine (0)

Teooria.
Glukoosisisalduse kvantitatiivseks maaramiseks bioloogilistes vedelikes kasutatakse laialdaselt ensumaatilist meetodit, mis pohineb kahe ensuumiglukoosi oksudaasi (GOD) ja peroksudaasi (POD) kasutamisel . Tanu GOD-i substraadispetsiifilisele b, D-glukoosi suhtes voimaldab see meetod maarata glukoosisisaldust ka teiste taandavate suhkrute juuresolekul.
GOD kujutab endast liitvalku- flavoproteiini, sisaldades proteetilise grupina FAD, mis toimub kui koensuum. Ta oksudeerib glukoos glukoonhappeks ja tekib viimasega ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
+O2 (GOD FAD->FADH2)+H2O COOH-(HCOH)4- CH2OH +H2O2
POD on koostiselt liitvalk – kromoproteiin, mis sisaldab prosteetilise ruhma heemi. POD kataluusib spetsiifiliste substraatide oksudeerumist. Reaktsiooni pohimotteline skeem on sellinne:
POD
Taandatud substraat +H2O2  Oksudeeritud substraat + 2H2O
(varviline)
Kaesolevas toos kasutatakse POD substraadina kaaliumheksatsuanoferraat(II) POD kataluusib selles Fe2+ oksudatsiooni Fe3+ -ks. Millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumtsuanoferraat(III) annab lahusele kollase varvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas.
POD
2Fe2+ +H2O2 +2H+  2Fe3+ +2H2O
Too kaik.
Tooreaktiivi koostis.
25 ml.

• 2,5 mg glukoosi oksudaasi
  
• 1,5 mg peroksudaasi
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0
  
• K-heksatsuanoferraat(II) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu taitmiseks kuni kaelal oleva margini.
  

Uuritav proov .
Kaalusin analuutilisel kaaludel kaaluklaasi 0,1019 g mett , viin teda kvantitatiivselt 25 ml mootekolbi. Tegin seda kuuma dest. Veega, mida lisasin vaikeste portsionitega 3 korda kaaluklaasi, klaasi sisu segasin vaikese klaaspulgaga ja tekkinud lahus valasin lahtri abil mootekolbi. Taidsin ca 1/3 kolvi mahust kuuma dest. veega ja kolbi hoidsin veevannis veel20 min, aeg-ajalt loksutasin. Parast jahutasin toatemperatuurini.
Glukoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks .
Glukoosi standartlahust valmistasin 1,0 mg/ml glukoosi konts. Lahusest. Valmistasin kolm lahjendust, mille glukoosi konts. On vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks votsin kolm puhast katseklaasi, kuhu pipeti abil mootsin eelnevalt valjaarvutatud kogus glukoosi standartlahust ja lisasin dest. vett margini. Katseklaasi sulasin korgiga ja hoolikalt loksutasin.
Reaktsiooni labiviimine.
Katseklaas nr.1: Pipeteerisin 1 ml distileeritud vett.(kontrollproov)
Katseklaasid nr.2,3: Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust (paralleelproovid)
Katseklaas nr.4: Pipeteerisin 1 ml glukoosisisaldus 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga .
Katseklaas nr.5: Pipeteerisin 1 ml glukoosisisaldus 0,125 mg/ml kontsentratsiooniga.
Katseklaas nr.6: Pipeteerisin 1 ml glukoosisisaldus 0,062 mg/ml kontsentratsiooniga.
Igasse katseklaasi pipiteerin 3 ml tooreaktiivi ja loksutan kohe, et saavutada uhtlast kontsentratsiooni. Katseklaasid hoian 20 min toatemperatuuril. Reaktsioonide tulemused varvivad glukoosi sisaldavad lahused tekkiva K-heksatsuanoferraat(III) toimel kollaseks. (Ei ole paris margatav).
Spektrofotomeetril moodan leinepikkusel 410 nm lahuse optilise tiheduse vaartust, kasutades vordluslahusena destileeritud vett.
Katseklaas nr.1: 0,061
Katseklaas nr.2: 0,141-0,061=0,08
Katseklaas nr.3: 0,141-0,061=0,08
Katseklaas nr.4: 0,200-0,061=0,139
Katseklaas nr.5: 0,125-0,061=0,064
Katseklaas nr.6: 0,090-0,061=0,029
Kalibrimisgraafik.
C= 0,08mg/ml V2= 1 ml
V1= 4 ml L=1,0 mg/ml
G=0,1019 g W=15%
X=C*V1*L*0,001*100/V2*G(1-W)=0,08*4*1*0,001*100/1*0,1019*0,85=0,369
Tulemuste analuus:Internetist leidsin, et mesi sisaldab umbes 36% glukoosi minu tulemus on 36,9%. Sellest selgud, et minu tulemus on oige ja analuus on labi viidud korrektselt.