Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Üliõpilane
Matrikli nr
õpperühm
Juhendaja:
Tallinn 2011
Töö teoreetilised alused:
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib β,D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni. Skeem: β,D- fruktofuranosiid + H2O → alkohol + fruktoos
Kõige levinum invertaasi substraat on sahharoos (koosneb α,D-glükoosist ja α,D-fruktoosist).
Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, ka paljud taimed, inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskestas toodetava invertaasi toimel.
Invertaasi aktiivust määratakse sahharoosi ja mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisega, mille põhjustab uuritav ensüümipreparaat. Reaktsioonisegus detekteeritakse vabandenud taandavad monosahhariidid glükoos ja fruktoos.
Sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon invertaasi toimel:
Reaktsiooduproduktid detekteeritakse komplektsomeetrilise meetodiga (põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi).
Invertaasi toimeks on vajalik happeline keskkond, seega komplekslahus toimub invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni.
Hüdrolüüsisegust võetakse proovid (sisaldavad taandavaid suhkruid), neid keedetakse ja vask(II) taandub vask(I)-ks, moodustub Cu2O, see eraldub segust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid.
1 μkat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30⁰C juures 1 μmol taandavat suhkrut (kutsub esile 1 μmol sahharoosi hüdrolüüsi).
Töö käik:
Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võtsin 50 ml katseklaasi, kuhu pipeteeritisin 25 ml 7 % sahharoosi lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahuse asetasin termostaati 30°C juures soojenema kümneks minutiks.
Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin vedelat invertaasi . Võtsin seda 0,3 ml, invertaasi lahust kokku oli 9 ml.
Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteerisin kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml 10 ml komplekslahust.
Substraadi lahusele lisasin 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi lahust. Loksutasin ja fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse.
Kuiva pipetiga võtsin kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteerisin 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning 20 min pärast 1 ml kolmandasse.
Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetasin 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel. Keetmise lõpetamiseks lisasin 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti. Võtsin kolvid pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini.
Reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määrasin 0,02 M CuSO4 lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimist lisasin igasse kolbi indikaatorina 8 tilka mureksiidi lahust, mille toimel kolvi sisu värvus sinakas-violetseks. Tiitrisin seni, kuni violetne värv asendus samblarohelisega.
Tiitrimisele kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimiskõveralt taandavate suhkrute sisalduse.
V(CuSO4), ml
C (mg/ml)
0-proov
1,8
1,60
10 minuti-proov
6,8
6,00
20 minuti-proov
11,5
10,15
Invertaasi aktivsuse leitakse kasutades valemi:
Kus:
C1 – taandavate suhkrute sisaldus aja hetkel T võetud proovis, mg 6,0|10,15
C2 – taandavate suhkrute sialduse 0 – proovis, mg 1,60
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht, ml 25,5 ml
1000 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s 600 | 1200
180 – glükoosi moolmass
V2 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml - 1ml
V3 – uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht, ml – 0,5 ml
A1 = (6,0-1,60)*25,5*1000 / 600 *180*1*0,5 = 2,08 μkat/ml
A2 = (10,15-1,60) *25,5*1000/1200*180*1*0,5 = 2,02 μat/ml
A = A1+ A2 /2 = 2,08 + 2,02 / 2 = 2,05 μkat/ml
Mul oli tegu 30 kordse lahjendusega, siis A = 2,05*30=61,5 μkat/ml
Järeldus:
Proovides sisaldusid taandavad suhkrud .
Taandavate suhkrute sisaldus kasvas (võrreldes 0, 10 ja 20 minuti proove).
1 ml antud invertiinipreparaadi toimel toodetakse 61,5 μmol-i taandavaid suhkruid sekundis.
Töö teostatud: