Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega (0)

Ainete tuvastamine kvalitatiivsete reaktsioonidega

Valkude reaktsioonid

Valgud on polüpeptiidid, mis koosnevad aminohappetest. Aminohapped on omavahel seotud peptiidsidemet abil. On olemas neli valku struktuuri tase. Valgumolekulide ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega. Valgu struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Aminohappelise koostise määramiseks kasutatakse värvusreaktsioone. Valkude denaturatsiooniprotesso uurimisel – sadestamismeetodid. Kvalitatiivsed reaktsioonid jagunevad kahte tüüpi: universaalsed (biureedireaktsioonid), mis on omased kõikidele valkudele , ja spetsiifilised, mis on iseloomulikud ainult teatud aminohapetele valgu molekulis.

Biureedireaktsioon

Annavad kõik ained, mis sisaldavad vähemalt kahte peptiidsidet. Leeliselises keskkonnas annab valk Cu2+ ioonidega sinakasvioletse, peptiid id aga roosa värvusega biureet – kompleksi.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust. Lisasin keskkonna leelistamiseks NaOH lahust, seejärel CuSO4 lahust, mis andis lahusesse Cu2+ - ioone. Lahuse värv muutus koheselt lillakaks, mis tõestas, et valk on hüdrolüüsunud, sest lahus ei muutunud roosaks. Ühtlasti tõestas katse valgu (peptiidsidemete) olemasolu leeliselises keskkonnas, kus on Cu2+ - ioone. Järelikult saab selle katsega tõestada valgu (peptiidsidemete) olemasolu (leeliselises) lahuses.

Ksantoproteiinireaktsioon (Mulderi reaktsioon)

Reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus. Konts. HNO3 lisamisel sadestub valk ja soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustub nitrofenool, kollase värvusega ja käitub kui hape .

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml munavalge lahust, lisasin 5 tilka konts. HNO3 ning soojendasin vesivannil . Aromaatsete tuumade nitreerumise tulemusena moodustus kollakas sade. Seejärel jahutasin segu ning lisasin NH4OH , mille tulemusena lahuse värvus muutus oranžikaks, mis tähendab, et lahus sisaldab aromaatse tuumaga aminohappeid . Jahutamisel tõestasime, et valk denatureerus pöördumatult ja NH4OH lisamisel, et moodustunud ühend käitub hape /alus indikaatorina. Katse tõestas, et kontsentreeritud lämmastikhape põhjustab valgu pöörumatut dentaturatsiooni ja välja sadestumist. Kuumutamisel aga sademes olevad aromaatsed tuumad nitreeruvad ning moodustavad nitrofenooli tüüpi ühendi, mis käitub happe/alus indikaatorina. Selle katsega on võimalik tõestada aromaatsete tuumadega aminohapete olemasolu valgu lahuses.

Miloni reaktsioon

Tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapate olemasolu valgus, kui lahuses on aromaatse tuumaga aminohapetega valke, siis muutub lahus Millioni reaktiivi lisades ( Hg(NO3)2 + HNO3 ) ning järgneval kuumutamisel värvuselt punakaks.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, teise 1ml zelatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Miloni reaktiivi ning soojendatakse. Munavalgu lahus muutus värvuselt punaseks, mis tõestas, et munavalgus on aromaatsete tuumadega aminohappeid. Zelatiini lahuses aga ei toimunud mingeid värvi muutuseid, mistõttu võib öelda, et sealt puuduvad türosiini radikaalid. Järelikult on see katse sobiv selgitamaks, kas valgu lahuses leidub türosiini radikaale.

Sulfhüdrolüüsireaktsioon (tioolreaktsioon)

Tõestab –SH rühma olemasolu valkudes. Leeliselises keskkonnas ja Pb++ juuresolekul ning lahuse kuumutamisel tekib must/ tumepruun sade kui valgu lahuses on –SH ioone.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml Pb( CH3COO )2 O,5% lahust, millele lisasin tilgakaupa 20% NaOH lahust kuni sademe tekkmiseni. Lisasin 0,5ml munavalgu lahust ning keetsin vesivannil. Tekkis pruun kolloidne sade, mis näitab tsüstesiini sisaldust valgus. Järelikult sobib see reaktsioon tsüstediini määramiseks valgus.

Valkude sadestamine trikloroäädikhappega

Trikloroäädikhape on valke denatureeriv ja sadestav reagent, aga ta ei sadesta valgu hüdrolüüsi produkte, mille molekulmass on alla 10 000. Seega kasutatakse TKÄ valkude eraldamiseks madalamolekulaarsetest lämmastikuühenditest.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, lisasin paar tilka CCl3COOH lahust, mille tulemusel tekkis valge sade, mis tõestas kõrgmolekulaarse(te) valgu(de) olemasolu lahuses kuna TÄK-il on valku denatureeriv ja sadestav toime, mis mõjub ainult kõrgmolekulaarsetele (molekulmass > 10000) valkudele. Järelikult on võimalik selle katsega kindlaks määrata kas lahus sisaldab peptiide, mille molekulmass on üle 10000. Samuti sobib see reaktsioon valkude eraldamiseks madalamolekulaarsetest lämmasikuühenditest.

Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)

Neutraalsete soolade kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude denaturatsiooni ja lahusest väljasadenemist. Globuliinid sadenevad poolküllastunud lahuses, albumiinid – küllastunud lahuses.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, lisasin 1ml küllastunud (NH4) 2SO4 lahust ning jätsin 5 min seisma. Eraldus globuliinide sade, sest nautraalsete soolade kõrged konsentratsioonid põhjustavad valkude väljasadestumist ning globuliinid sadestuvad poolküllastunud lahuses, sademe eraldasin filtrimisel . Seejärel lisasin (NH4)2SO4 lahust küllastumiseni, mille tulemusel moodustus valge sade. Selles sademes olid albumiinid, kuna nemad sadestuvad küllastnund lahuses. Katse tõestas, et neutraalsete soolade kõrged konsentratsioonid põhjustavad valkude väljasadestumist. Globuliinid sadestuvad soola poolküllastunud lahuses ja albumiinid soola küllastunud lahuses.

Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st

Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril millele kaasneb tavaliselt valgu väljasadestumine. Kui keskkonna pH väärtus on tunduvalt erinev valgu isoelektrilisest täpist, siis võib juhtuda,et valk ei sadestu kuumutamisel välja.

Töö käik

Valasin kahte katseklaasi 1ml munavalgu lahust, millest ühte lisasin äädikhapet. Kuumutasin mõlemat katseklaasi vesivannil. Katsekaasi, kuhu olin lisanud äädikhapet sadet ei tekkinud kuna keskkonna pH väärtus oli valgu isoelektrilisest täpist niivõrd erinev, et valk ei denatureerunud, mistõttu ka sadet ei tekkinud. Puhas munavalgu lahus aga denatrueerus soojendamise tulemusena ning valk sadestus välja. Katse tõestas, et kui lahuse pH on valgu isoelektrilisest täpist palju erinev siis kuumutamisel denaturatsiooni ei toimu, ühtlasi tõestas katse ka seda, et kui keskkonna pH on valgu isoelektrilise täpi lähedane siis kuumutamisel valk dentatureerub ning sadestub välja.

Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega

Etanool , atsetoon jt veega segunevad solvendid põhjustavad valkude dehüdratiseerumist ja sadestavad neid lahusest välja.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, lisasin etanooli kuni moodustus sade. See tõestas, et orgaaniline solvent sadestab valgu välja ehk dehüdratiseerib valku. Lisasin samale lahusele destileeritud vett, mille tulemusena sademes mingeid muutuseid ei toimunud, kuigi oleks pidanud. (tõenäoliselt lisati vett liiga kiirest või suures koguses ning tekitati solvenid lokaalne kõrge konsentratsioon , mis põhjustabki pöördumatut denaturatsiooni). Järelikult orgaanilised lahustid põhjustavad valkude pöörduvat dentaruratsiooni, kui ei tekitata orgaanilise lahusti liiga kõrget lokaalset konsentratsiooni.

Süsivesikute reaktsioonid

Organismis energeetiliste ja ehituslike ülesannetega samuti on nad ka energeetilised varuained. Struktuuri järgi jaotatakse süsivesikud mono -,oligo-ja polüsahhariidideks. Monosahhariidid on lihtsuhkrud , ühesuguste koostiste ,kuid erinevate struktuuridega ühendid (looduses enim levinud). Oligosahhariidide molekulid monosahhariidide jääkidest. Polüsahhariidi moodustab suur arv ühinenud lihtsuhkruid.

Molischi test

Süsivesikute olemasolul tekib nende segus alfa-naftooliga kontsentreeritud väävelhappe lisamisel happe ja uuritava lahuse piirpinnale purpurne vahekiht.

Töö käik

Valasin ühte katseklaasi 1ml sahharoosi lahust ja teise 1ml laktoosi lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 5-6 tilka Molischi reaktiivi ja ettevaatlikult 1ml kontsentreeritud H2SO4. Sahharoosi sisaldava lahuse ja happe piirpinnale tekkis punakas reaktsiooniprodukt, laktoosi lahuse ja happe piirpinnale aga kollakas reaktsiooniprodukt. Järelikult Molischi test tõestab kõikide süsivesikute olemasolu lahuses. Erinevate värvide põhjal on võimalik ka oletada, millise süsivesikuga võiks tegemist olla.

Osasoonide saamine

Osasoonideks nimetatakse taandava suhkru ja kahe molekuli fenüülhüdrasiini liitumise produkti . Osasoonid kristalluvad hästi ning kristallide kuju, sulamistemperatuur on lähtesuhkrutele iseloomulikud ning seeläbi saab neid identifitseerida.

Töö käik

Valasin ühte katseklaasi 1ml arabinoosi lahust ja teisse 1ml glükoosi lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin fenüülhüdrasiini ja naatriumatsetaati. Kuumutasin 40min vesivannil ning jahutasin jääkastis. Seejärel uurisin tekkinud kristalle mikroskoobis. Selle katse abil on võimalik saada suhkrute osasoone, mille abil on võimalik kindlaks teha suhkrute kristallstuktuure (osasoonide kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud), ning suhkruid identifitseerida.

Hõbepeegli reaktsioon

Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm redutseerib mitmete metallide sooli. Kui segus on redutseeruv suhkur siis hõbeda ammoniakaalsest lahusest sadestub metall klaasi pinnale hõbekihina.

Töö käik

Valasin katseklaasi 1ml 1% AgNO3 ja 0,5ml NH4OH lahust. Seejärel lisasin 1ml glükoosi lahust ning kuumutasin vesivannil. Kuumutamisel sadestus Ag põhja ning moodustas hõbepeegli, kuna glükoos on taandav suhkur ning taandas Ag välja. Selle katsega on võimalik kindlaks teha taandavate suhkute olemasolu lahuses.

Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahusega

Taandavate suhkrute määramiseks kasutatakse Fehlingi reaktiivi, mis redutseeruvate suhkrute korral annab lahusesse punase sademe. Sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos . Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada ensümaatiliselt või happe toimel

Töö käik

Valasin kahte katseklaasi 1ml sahharoosi lahust, millest ühte lisasin ühe tilga HCl lahust ning kuumutasin vesivannil 5 min. Lisasin mõlemasse katseklaasi 1ml Fehlingi I ja Fehlingi II lahust. Tumesinine HCl-i sisaldav lahus muutus kuumutamiselt punakas aga teine oma värvi ei muutnud. HCl-i sisaldav lahus muutus punaseks sellepärast, et hape kiirendas hüdrolüüsi ning glükoos reageeris Fehlingi reaktiiviga. Järelikult sobib Fehlingi reaktiiv taandavate ja redutseerivate suhkrute kindlakstegemiseks, kuna viimaste korral annab ta lahusesse punase sademe.

Barfoed reaktsioon

Barfoed’ reaktiiv võimaldab eristada taandavaid mono-ja disahhariide, kuna happelises keskkonnas taandavad vaske monosahhariidid ,aga mitte disahhariidid. Kui tegemist on monosahhariididga, tekid katseklaasi tumepunane sade.

Töö käik

Ühte katseklaasi valasin 1ml glükoosi lahust ja teise 1ml laktoosi lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin Barfoed reaktiivi ning kuumutasin vesivannil. Glükoos moodustas punaka sademe ehk taandas vase välja, laktoosi lahus aga värvi ei muutnud. Järelikult on glükoos monosahhariid ja laktoos polüsahhariid. Selle reaktsiooniga on võimalik määrata, kas tegemist on mono- või disahhariidiga. Disahhariidi puhul tekib katseklaasi tumepunane sade, monosahhariid aga jääb värvituks.

Selivanoffi reaktsioon

Suhkrute kuumutamise happelises keskkonnas tekivad ühendid,mis reageerivad mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte. Nende värviliste produktide abil saab määrata suhkruid. Selivanoffi reaktiivi kasutataksegi suhkrute määramiseks pärast kuumutamist nende värvi alusel.

Töö käik

Ühte katseklaasi valasin 1ml fruktoosi lahust ja teise 1ml glükoosi lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 2ml Selivanhoffi reaktiivi ning soojendasin vesivannil. Glükoosi lahus muutus tume oranžiks ja fruktoosi lahus tumepruuniks. Mida kauem kuumutada seda tumedamaks värvid muutusid kuni neid polnud enam võimalik värvi järgi eristada. Kuumutamisel tekkinud ühendid polükondenseerusid mitmealuseliste fenoolidega ning andsid värvilisi produkte. Eristamatuks muutusid lahused pärast pikka kuumutamist sellepärast, et liiga palju suhkru molekule polükondenseerusid ning varem eristatav värv muutus järjest (intensiivsemaks) tumedamaks. Suhkrute kuumutamisel mineraalhapete juuresolekul tekkisid ühendid mis reageerisid mittealuseliste fenoolidega andes värvilisi produkte. Selivanhoffi reaktiive saab kasutada suhkrute määramiseks pärast kuumutamist nende värvi alusel.

Tärklise reaktsioon joodiga

Tärklis ja jood annavad lillakassiniseid komplekse, mis on tingitud sellest, et tärklises olevad polüsahhariidiahelad keerduvad joodi molekulide ümber. Kõrgel temperatuuril kompleksid lagunevad ja kaotavad värvuse.

Töö käik

Valasin katseklaasi 4ml tärkliselahust ning 1 tilk joodilahust. Segu kuumutasin vesivannil. Kuumutamisel muutus sinine lahus värvituks ning jahtudes taas siniseks ehk tärklis kuumutamisel denatureerus aga jahtudes renatureerus. Järelikult on joodi abil võimalik muuta tärkliseterakesed mikroskoobi all hõlpsamini vaadeldavaks ning identifitseeritavaks. 1) Kartulitärklis
2) Maisitärklis