Invertaasi aktiivsuse määramine (0)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr.3.1
Anna Logunova YAGB-22
Invertaasi aktiivsuse määramine
Teooria
Invertaas , süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk lihtsamalt β-fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside
ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi.
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:
Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos , mis koosneb α,D-glükoosist ja β,D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel.
Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse
Kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi.
Vask(II)-triloon B kompleks täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli:
• tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt ≅ 4,8,
inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni.
• tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-
triloon B kompleksi.
Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust.
Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (μkat/ml).
Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Valmistan 10 ml töölahust tahkest invertaasist, kontsentratsiooniga 5mg/ml. Lahustina kasutan atsetaatpuhver pH väärtusega 4.8.
Invertaasi kontsentratsioon on 5mg/ml ja lahuse maht on 10 ml tuleb kaaluda analüütilisel kaaludel 50 mg (0,05 g) tahket invertaasi.
Selleks, et valmistada töölahust tuleb:

• Loputada kaaluklaasi väikese kogusega atsetaatpuhver lahusega.
  
• Kaaluda analüütilisel kaaludel kaaluklaasi ilma ensümideta.
  
• Kaaluda vajalik ensüümi kogus.
  
• Valada ensüüm gradueeritud katseklaasi ja lisada vajalik atsetaatpuhvri kogus.
  
• Segada klaasi sisu umbes 5 min. Klaaspulgaga,kuni ühtlase suspensiooni moodustumiseni.
  

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtan 50 ml mahuga katseklaas ,kuhu pipeteerin 25ml substraati,milleks on
7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaas varustan fooliumiga ja asetan umbes 10 minutiks vesitermostaati 30 ºC juurde soojenema.

Võtan kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml,kuhu pipeteerin 10 ml komplekslahust.

Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30 ºC lisan sellele 0,5ml uuritavat invertaasi töölahust,lahus loksutan kiiresti. Asetan katseklaas termostaati tagasi.

Kohe peale reaktsiooni segu läbiloksutamist võtan sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja lisan ühte kolbidest,kus on kompleks lahus. See on 0- proov .

10 minutit peale ensüümreaktsiooni algust võtan sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja lisan teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.

20 minutit peale ensüümreaktsiooni algust võtan veel 1 ml reaktsioonisegu ja lisan kolmandasse kolbi.
Peale viimast proovi võttmist eemaldan katseklaasi termostaadist.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid , asetan 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimub vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel. Keetmine lõpeb umbes 150 ml destilleeritud vee lisamisega kolbi läbi püstjahuti. Kolvid võtan pliidilt ja jahutan kraanivee all toatemperatuurini.
Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määran 0,02 M CuSO4 lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimisele asumist lisan igasse kolbi indikaatorin umbes 5 tilka mureksiidi lahust, mille toimel kolvi sisu värvub violetseks. Tiitrin seni, kuni violetne värvu asendub samblarohelisega.
Tiitrimisele kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leian kaliibrimiskõveralt taandavate suhkrute sisaldus proovis.
Töö tulemused
Proov nr.
0,02M CuSO4 (ml)
Glyc (mg/ml)
0
8 ml
7,1 mg/ml
1
2
19,5 ml
17,2 mg/ml
*** Esimeses proovis ei ole tulemusi,sest kogu kolvi sisu oli juhuslikult välja valatud kraanikausi. Seetõttu katse tulemus põhineb 0 ja 2 proovidel.
Invertaasi aktiivsus arvutatakse valemi järgi:
C1– taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg. 17,2
C2 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg. 7,1
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht, ml. 25,5
1000 – tegur üleminekuks mikrogrammidele.
T – hüdrolüüsi kestus, s. 1200
180 – glükoosi molaarmass
V 3– proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml. 11 ml
V2–ensüümi töölahuse üldmaht, ml. 10ml
V4– uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht, ml. 0,5 ml.
G-ensüümipreparaadi kaalutis. 0,05g
(μkat/ml).
Järeldus: Katse näitas,et glükoosi sisaldus kasvab reaktsioonia aega suurendamisel.Mida kauem reaktsioon toimub,seda suurem on glükoosi kontsentratsioon. Invertaasi aktiivsus on 430 μkat/ml.
Kasutage uues juhendis lk 78 toodud valemit tahke preparaadi jaoks.