Invertaasi aktiivsuse määramine (1)

Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib beeta, D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavalt skeemile:
􀈕, D - fruktofuranosiid + H2O 􀄺 alkohol + fruktoos
Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Vastavatalt toodud skeemile leiab invertaasi toimel aset sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon . Tekkinud reaktsiooniproduktide, glükoosi ja fruktoosi, koguse kindlaks tegemiseks kasutatakse antud töös kompleksomeetrilist meetodit, kus põhiliseks reaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi.
Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades vask(I)oksiidi, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust.
Töö käik:

Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks kasutasime suuremat katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 7% sahharoosi lahust, mis oli substraadiks ja mille pH oli 4,8. Lahuse asetasin vesitermostaati 30 kraadi juurde soojenema.

Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Pipeteerisin kolme koonilisse kolbi 250 ml komplekslahust.

Tahket invertaasi kaalusin 24,5 mg ja lahustasin 0,5 ml atsetaat puhvris.

Kui sahharoosi lahus oli küllalt soojenenud lisasin termostateeritud sahharoosi lahusele 0,5ml uuritavat invertaasi lahust, loksutasin ja hakkasin aega mõõtma.
Kohe peale ensüümi lisamist võtsin 1ml hüdrolüüsisegu ja viisin selle ühte kolbudest, kus oli komplekslahus (0 proov ).

10 minuti pärast pipeteerisin veel 1ml reaktsioonisegu ja lisasin selle teise komplekslahusesse ning 10 minuti pärast kordasin sama tegevust veel kolmanda kolviga.

Kui ensüüm lisatud kõikidesse kolbidesse, siis asetasin proovid 10 minutiks elektripliidile püstijahuti alla keema . Keetmise lõpetasin 150 ml destilleeritud veel lisamisega kolbi läbi püstjahuti. Jahutasin kolvid kraanivee all.

Reaktsioonil vabanenud triloon B kogust hakkasin määrama 0,02M vasksulfaadi lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimist lisasin igasse kolbi 6 tilka mureksiidi lahust, mille toimel kolvi sisu värvus violetseks. Hakkasin tiitrima ja tiitrisin seni, kuni kolvis olev proov värvus samblaroheliseks.
Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse kogus ja vastavad suhkrute kontsentratsioonid olid järgmised:
V C
0 proov 0,5ml 0,4
1 proov 7,9ml 7
2 proov 13,5ml 12
Invertaasi aktiivsuse määrasin valemi järgi:
Kus C1= taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg
c2= taandavate suhkrute sisaldus 0 proovis, mg
V1= hüdrolüüsisegu üldmaht, ml
1000- tegur üleminekuks mikrogrammidele
T- hüdrolüüsi kestus, s
180- glükoosi moolmass
V2= proovi mahttaandavate suhkrute määramiseks, ml
V3= uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht, ml
Kokkuvõte
Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia praktikum
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
1.04.2009
Maria Simmul
082619
YAGB -21
Juhendaja : Malle Kreen
Tallinn 2009