Biokeemia praktikumi protokoll (0)

Biokeemia praktikumi protokoll
Töö 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine
Üliõpilane: Jaroslav Marhivka (rühm B)
Juhendaja : Ly Villo
Teaduskond ja eriala: Matemaatika- ja loodusteaduskond, Geenitehnoloogia
Matrikli Nr :134369 YAGB
Sissejuhatus
Invertaas – -D-fruktofuranosiidi fruktohüdralaas (E.C. 3.2.1.2.6) – ensüüm , mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka (glükosidaaside hulka). Glükosidaasid katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi järgmiselt: Glükosidaas
Polü- või Oligosahhariid +
Monosahhariid + (lühem)Polü- või Oligosahhariid
Antud töös vaadeldatakse sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon , mis kulgeb C ja pH=4,8 juures. Reaktsiooni produktideks on -D-glükoos ja -D- fruktoos .
Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi, kui mittetaandava suhkru hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute summaarse kontsentratsiooni määramisel segus. Töös kasutasime kompleksomeetrilist meetodit, milles põhireaktiiviks on -triloon-B kompleks (tugevalt aluseline). Seda valmistatakse ,
ja triloon-B lahustest (siin kasutan eelnevalt valmistatud segu). Sellel reaktiivil on antud töös 2 rolli:

• inaktiveerib invertaasi (kompleksil on kõrge pH), kuna invertaasi ,
  
• tagab taandavate suhkrute määramiseks leeliselist kekkonda ja vask()-triloon B kompleksi.
  

Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub
taandavate suhkrute toimel -ks, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvimolaarses koguses vaba triloon-B. Järgneb triloon-B kontsentratsiooni määramine tiitrimisel kasutades 0,02 M lahust. Toimub vase taaskomplekseerumine triloon-B-ga ja seda saab visualiseerida, kui lisada lahusesse indikaator mureksiid (lahuse värvus muutub violetsest roheliseks). Tiitrimiseks kulunud
mahu järgi leitakse varem koostatud kaliibrimisgrrafikust taandavate suhkrute kontsentratsiooni.
Töö käik

Valmistan ensüümipreparaadi lahust. Tahke preparaadi mass g=10 mg, lahustiks – atsetaatpuhver (5ml), töölahuse kontsentratsioon 2 mg/ml.

50 ml katseklaasi pipeteerin 25 ml 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris (pH=4,8), varustan katseklaas korgiga ja asetan termostaati 10 minutiks C juures.

Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteerin igasse 10 ml komplekslahust.

Kui substraat saavutas temperatuuri , lisan sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutan ja asetan termostaati. Reaktsiooniks kulgenud aeg fikseerin stopperiga.

Kohe peale reaktsiooni segu läbiloksutamist pipeteerin 1 ml reaktsioonisegu lahust komplekslahusega kolbi (proov 1). 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust pipeteerin 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi (proov 2). 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust pipeteerin 1 ml reaktsioonisegu kolmandasse kolbi (proov 3).

Koonilised kolvid asetan pliidile püstjahutite alla ja keedan neid 10 minutit. Kolvidesse tekib punane vask (1) oksiidi sade.

10 minuti pärast lõpetan keetmist, lisades igasse kolbi 150 ml destilleeritud vett. Jahutan kolvid kraanivee all toatemperatuurini.

Lisan igasse kolbi 0,6 ml mureksiidi. Proovid omandavad violeetset tooni.

Tiitrin 0,02 M lahusega kuni roheka värvuse ilmumiseni. Esimesele proovile kuulus 4,5 ml lahust, teisele – 17 ml lahust, kolmandale – 29,5 ml lahust.
10. Leian taandavate suhkrute sisaldust kaliibrimisgraafiku järgi:

• 1 proov, C=4 mg/ml
  
• 2 proov, C=15 mg/ml
  
• 3 proov, C=26 mg/ml
  

11.Arvutan aktiivsusi ja :
– taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
– taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
– reaktsioonisegu üldmaht, ml
– ensüümi töölahuse üldmaht, ml
– proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
– ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
– hüdrolüüsi kestus, s
=26ml, =5ml, =1 ml; 10 min =600 s.
Järeldus
Töö on läbiviidud korrektselt, kuna saadud aktiivsuste väärtused langevad kooku . Antud töös uuritava invertaasi aktiivsus on . Nii täpne kokkulangevus võib olla põhjustatud sellest, et aeg ei olnud mõõdetud sekundi täpsusega.