3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll (2)

Tallinna Tehnikaülikool
3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine

Biokeemia labori protokoll

2011

Töö teoreetilised alused

Invertaas ehk β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside hulka, mis katalüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi.
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Invertaas
β-D-fruktofuranosiid + H2O → β,D- fruktoos + mono - või oligosahhariid
Sahharoos on looduses enim levinud β-D-fruktofuranosiid, tema hüdrolüüüsi reaktsiooni produktidena tekivad β,D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produktseerivad pärmid, hallitusseened, mitmed taimed ja mesilased. Invertaas on oluline seedeensüüm, mida toodavad peensoole limaskesta rakud . Invertaasi toimel hüdrolüüsub organismis sahharoos.
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi hüdrolüüsil invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks.
Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov . Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade.
Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii:
Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitrimisel komplekseerub triloon B Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist saab kindlaks määrata indikaator mureksiidi värvuse muutumise järgi.
Taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi kaliibrimissirgelt. Kui on tegemist vedela ensüümipreparaadiga, siis avaldatakse invertaasi aktiivsus mikrokatalites ensüümilahuse 1 mL kohal, tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta.

Katse käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

Valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Selleks mõõtsin kaliibritud katseklaasi pipetiga 0,5 mL vedelat ensüümipreparaati invertiin ning lisasin sellele 9,5 mL atsetaatpuhvrit, mille pH oli 4,8. See tähendab, et tegin 20 kordse lahjenduse. Loksutasin katseklaasi.

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtsin sobiva suurusega katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH-ga 4,8 ( substraat ). Sulgesin katseklaasi ning panin 10 minutiks vesitermostaati 30⁰C juurde.
Kolme 250 mL-sse koonilisse kolbi, pipeteerisin igasse ühesse 10 mL komplekslahust.
Võtsin termostaadist 30⁰C-ni soojendatud substraadi ning pipeteerisin sinna 0,5 mL valmistatud invertaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu, siis võtsin kohe 1 mL lahust sealt ning lisasin ühele komplekslahusele kolvis. See oli 0-proov ja iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel .
Reaktsioonisegu katseklaasiga panin kohe tagasi termostaati ning lasin sellel seal olla 10 minutit ehk 600 sekundit. Seejärel kordasin toimingut, võttes jälle pipetiga 1 mL reaktsioonisegu ja lisades järgmisesse koonilisse kolbi komplekslahusele.
Panin kolmandat korda reaktsioonisegu tagasi vesitermostaati ja lasin veel olla 9 minutit (st ensüümireaktsiooni algusest 10+9=19 minutit ehk 1140 sekundit) ning toimisin jälle samamoodi.
Lõpetuseks eemaldasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Kolvid, mis sisaldasid komplekslahust ja erinevatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proove, panin elektripliidile püstjahutite alla keema 10 minutiks.
10 minutit pärast keemise algust lõpetasin keetmise lisades läbi püstjahuti kolbidesse 150 mL destilleeritud vett. Vedeliku maht kolvis suurenes ja indikaatori värvuse muutus peaks niimoodi olema paremini märgatav tiitrimisel. Võtsin kolbid pliidilt ja jahutasin kraani all maha.
Lisasin igasse kolbi 3 tilka mureksiidi vesilahust kui indikaatorit, mis andis lahustele õrnalt violetse tooni.
Tiitrisin lahuseid 0,02 M CuSO4 lahusega kuni sinakas -violetne värvus asendus rohekassinaka-smaragdrohelise värvusega. Fikseerisin titrandi kulu, kui märkasin esimest värvi muutust, lõplikult määrasin titrandi kulu kindlaks sellega, kui titrandi lisamisel enam roheline toon ei kadunud, vaid jäi püsima.
Tiitrimistulemused:
V1 = 2,2 mL (0-proov)
V2 = 10,3 mL (ensüümireaktsiooni algusest 10 min-proov)
V3 = 18,4 mL (ensüümireaktsioonialgusest 19 min-proov)
Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafikult taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 mL-s reaktsioonisegust võetud proovis.
C1 = 1,9 mg/L
C2 = 9,1 mg/L
C3 = 15,25 mg/L
Vedela invertaasi preparaadi uurmisel avaldatakse aktiivsus ensüümipreparaadi 1 mL kohta (μkat/mL).
Aktiivsuse arvutus: , kus
C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/mL
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, mL
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, mL
103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, sek
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, mL
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, mL
L – lahjendusmäär, mida kasutatai vedelast ensüümipreparaadist töölahuse valmistamisel
Kahe aktiivsuse aritmeetiline keskmine kui invertaasi preparaadi aktiivsus:

Järeldus

A10 ja A19 peaksid kokku langema või üksteisest erinema maksimaalselt 20 % võrra. Minu tulemuste erinevus on: A19 A10-st → 66,36 68,00-st → (66,36/68)*100 % = 97,59 %.
Erinevus: 100 %-97,59 % = 2,41 %.
Aktiivsuste erinevus minu poolt sooritatud töös ei ole suur, seega võib katse selles mõttes lugeda õnnestunuks. Samuti langeb aktiivsus samasse suurusjärku, mille ütles õppejõud.
Kuna katset sooritasid ka 2 teist üliõpilast samadel tingimustel valmistatud lahustega , siis oleks pidanud tulemused olema ühesugused, mida nad aga ei olnud. See erinevus võib olla tingitud näiteks üle- või alatiitrimisest (värvuse muutumist märgati liiga hilja või just ei tiitritud lõpuni). Samuti võis esineda ajalisi nihkeid, kuna mõõtsime aega seinakellaga, aga mitte stopperiga, mis oleks andnud täpsema tulemuse.