INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (0)

TTÜ keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL0060 Biokeemia
Laboratoorne töö nr: 3.1. Töö pealkiri: INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teostaja : MIHKEL HEINMAA Õpperühm: YAGB22 Õppejõud: MALLE KREEN Töö teostatud: 12/04/2010 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.1.) TEOORIA
Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib ,D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavlt skeemile: ,D-fruktofuranosiid + H2O alkohol + fruktoos.
Ensüüm võib katalüüsida ka fruktoosijäägi ülekannet. Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel.
Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Vastavalt toodud skeemile leiab invertaasi toimel aset sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon . Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse siin nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni.
Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B.
Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust.
Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. (µkat/ml). TÖÖ KÄIK
Sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks võeti 50 ml katseklaas , kuhu pipeteeriti 25 ml 7 % sahharoosi lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahus asetati termostaati 30oC juures soojenema kümneks minutiks.
Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust.
30oC termostateeritud sahharoosi lahusele lisati 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi ­ invertiini lahust. Loksutati ja fikseeriti ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi.
Kuiva pipetiga võeti kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viidi ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See oli 0- proov , mis iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel . 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeriti 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning omakorda 10 min pärast 1 ml kolmandasse.
Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid , asetati 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel. Keetmine lõpetati umbes 150 ml destilleeritud vee lisamisega kolbi läbi püstjahuti. Kolvid võeti pliidilt ja jahutati kraanivee all toatemperatuurini.
Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määrati 0,02 M CuSO4 lahusega tiitrimisel. Enne tiitrimisele asumist lisati igasse kolbi indikaatorin umbes 7 tilka mureksiidi lahust, mille toimel kolvi sisu värvu violetseks. Tiitritakse seni, kuni violetne värvu asendub samblarohelisega. Tiitrimisele kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leiti kaliibrimiskõveralt taandavate suhkrute sisaldus proovis. TULEMUSED
PROOV (#) 0,02 M CuSO4 (ml) Glyc (mg/ml) 0 1,4 1,3 1 9,7 8,6 2 18,1 16 16 15 14 13 12 Glükoos (mg/ml)
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 Aeg t (min)
Invertaasi aktiivsus arvutatakse valemi järgi:
C1 ­ taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg. 8,6 | 16 C2 ­ taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg. 1,3 V1 ­ hüdrolüüsisegu üldmaht, ml. 25,5 1000 ­ tegur üleminekuks mikrogrammidele. T ­ hüdrolüüsi kestus, s. 600 | 1200 180 ­ glükoosi molaarmass V2 ­ proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml. 1 ml V3 ­ uurimiseks võetud invertaasi lahuse maht, ml. 0,5 ml.
Kuna oli tegu 30 kordse lahjendusega, siis See tähendab, et 1 ml invertiini aktiivsus on 103,77 katalit ­ 1 ml invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 103,77 µmol'i taandavat suhkrut sekundis.