Geenitehnoloogia I konspekt (2)

TTÜ | MIHKEL HEINMAA | SÜGIS MMIX
GEENITEHNOLOOGIA YTG0011 LOENGU KONSPEKT SÜGIS 2009 LUGES ERKKI TRUVE TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL | MATEMAATIKA -LOODUSTEADUSKOND |GEENITEHNOLOOGIA MIHKEL HEINMAA |YAGB11
VALGUD
24/09/09 Miks üldse rakkudel on vaja DNAd? Elusa raku muudab elusaks rakuks kõik need biokeemilised reaktsioonid, mis nendes rakkudes toimuvad ja need biokeemilised reaktsioonid toimuvad neis rakkudes ainult tänu sellele, et meil on olemas valgud, katalüsaatorid, mis neid reaktsioone teostavad. Ehk teisisõnu, valgud on tegelikult need, mis teevad elusast rakust elusa raku. DNA ainuke roll on säilitada infot, kuidas need valgud kokku panna.
Me juba teame, et nukleiinhapped on polümeerid, millede monomeerideks on nukleotiidid . Valgud on ka polümeerid, millede monomeerideks on aminohapped . Kui nukleotiidid polümeriseerusid, siis nende vahele moodustusid fosvodiestersidemed. Valgu molekulis ühendavad aminohappeid peptiidsidemed. Erinevaid aminohappeid on 20. Keemiline mitmekesisus aminohapete seas on suur. Üks kõik milliseid reaktsioone ei oleks vaja rakkudes katalüüsida või ükskõik milliseid struktuure, meil ei oleks vaja valkude abil rakkudes kokku panna, siis vähemalt teoreetiliselt on see võimalik, sest aminohapete mitmekesisus on niivõrd suur, et see vähemalt idee poolest võimaldab meil sisuliselt ükskõik mida nende abil kokku panna. Sõltumata sellest, kas kõrvalrühmad aminohappetes on lihtsad või keerulised, kõikki aminohappeid iseloomustavad amiinorühm ja karboksüülrühm. Tänu neile suudab ribosoom suvaliste aminohapete vahele tekitada peptiid sidemeid , kõrvalrühmad, mis kannavad kindlaid omadusi peptiid sidemete moodustamisel ei osale. Süsiniku ja lämmastiku vahel moodustub peptiidside. (Peptiide ja valkude vahe: peptiidid on lühikesed valgu molekulid ja nendel ei teki väga kindlat muutumatut kolmemõõtmelist struktuuri).
Kui aminohappejäägid on polümeriseeritud üheks molekuliks, siis seal näeme, et selle polümeeri otsad erinevad üksteisest. Ühte otsa jääb vaba aminorühm, mis ei moodusta peptiidsidet . Teise otsa jääb vaba karboksüülrühm, mis samuti ei moodusta peptiidsidet. Nii räägimegi valkude puhul amiinoterminaalsest otsast või N-terminaalsest otsast ja karboksüülrühmast või C terminaalsest otsast. Nii on ka valkudel oma orientatsioon ja süntees toimub alati N-terminusest C-terminuse poole, ehk järgmine aminohappe jääk lülituks C-termaalsesse otsa.
Kuidas valkusid sünteesitakse? Kuidas ribosoom teab, milline aminohappe jääk tuleb järgmisena sünteesitavasse valgu molekuli lülitada? On olemas sellised reeglid, et näiteks kui saabub ribosoomi selline mRNA osa, milles kõrvuti on näiteks tähed UCA, siis ribosoom teab, et tuleb lülitada Seriin jne. Geneetiline kood on reeglite kogum, mis ütleb millisele nukleotiidide järjestusele, millisele koodonile mRNAs vastab üks aminohappejääk sünteesitavas valgu molekulis. Igas koodonis on kolm nukleotiidi (vähemaga ei saa vajalikku erinevat 20 aminohapet moodustada ja rohkemaga pole otstarbekas). Erinevaid nukleotiidide kombinatsioone koodonites saab olla 64. Mis tähendab, et mitmed erinevad koodoni kodeerivad ühtesid ja samu aminohappeid. (kolm koodonit aminohappeid ei kodeeri).
Uute nukleiinhappete süntees toimus komplementaarsusprintsiibi alusel. Geneetilisel koodil pole mingisugust teaduslikku seletust. Koodon ei puutu kunagi füüsiliselt kokku selle aminohappega mis parasjagu sinna valgu molekuli lülitatakse. Kõik organismid Maal kasutavad ühte ja seda sama geneetilist koodi, mis viitab sellele, et elu Maal on tekkinud üks kord juhuslikult ja kõigil organismidel on ühine eellane. See võimaldab ka geenimanipulatsioone, teades, et iga organism saab sellest geenist alati ühte moodi aru.
tRNA transpordib aminohappejääke ribosoomidesse. tRNA 3' otsa võidakse liita üks aminohape st tekib seos nukleiinhappe ja aminohappe vahel (hüdroksüülrühma ja aminohappe karboksüülrühma vahele tekib keemiline side, mida mujal ei esine) Sellist tRNA molekuli nimetatakse aminoatsüül-tRNA'ks. Sideme tekke protsessi nim aminoatsüleerimiseks. tRNA'l on selline piirkond, mida kutsutakse antikoodoniks. tRNA antikoodon on võimeline paaduma mRNA's oleva koodoniga komplementaarsusprintsiibi alusel. Transporditaval aminohappel pole mingit rolli tRNA ja mRNA omavahelisel paardumisel. tRNA peab vastama korraga kahele tingimusele: tema küljes peab olema õige aminohappejääk ja rakkudes peavad olemas olema kõik võimalike koodonitega tRNA, et suvalisele (61) mRNAle oleks vaste. Kui tRNA'de külge pannakse aminohappeid, siis õige tRNA külge tuleb panna õige aminohappejääk. See protsess, kus aminohappe jääk liidetakse tRNA külge ei toimu iseenesest vaid ensüümide, katalüsaatorite võimaldamisel. Neid ensüüme nim aminoatsüül-tRNA- süntetaasideks. Nad sünteesivad erinevad erinevaid aminoatsüül-tRNA'sid. Rakkudes on 61 erinevat aminoatsüül-tRNA-süntetaasi, mis igaüks peab ära tundma õige tRNA, mille külge peab tema aminohappe lisama. See on võimalik tänu sellele, et kõikidel tRNA'del on selline ristikheinalehe kujuline struktuur. (ristikheinalehe kujuline seepärast, et vaba lämmastikalus RNAs leiab endale komplementaarse lämmastikaluse selle sama molekuli sees, siis ta moodustab sellega vesiniksideme. Seetõttu ei ole RNA pikk sirge niit vaid omandab kindlalt fikseeritud ruumilise struktuuri, igal kindlal RNAl on see erinev, kuna nukleotiidne järjestus on erinev). tRNAs osa juba polümeeri koostises olevatest nukleotiididest modifitseeritakse (pannakse juurde täiendavaid keemilisi rühmasid), mis muudab iga konkreetse tRNA ruumilist struktuuri. Lõppkokkuvõttes võimaldab see seda, et iga konkreetne aminoatsüül-tRNA-süntetaas tunneb ära ainult mingit ühte konkreetset tRNA'd, sest ainult selle tRNA kolmemõõtmeline struktuur on selline, et ta on võimeline selle ensüümiga interakteeruma. Samal ensüümil on ka teine substraati ära tundev piirkond, mis tunneb ära ainult ühte konkreetset aminohapet.
1 TTÜ | MIHKEL HEINMAA | SÜGIS MMIX 01/09/10 Rakkudes on tRNA'd mis on aminoatsüleeritud ehk mille küljes on aminohappejäägid ja rRNA'd ja mRNA'd. Kuna mRNA on pikk ja seal on palju koodoneid, siis pmst võime kujutleda sellist situatsiooni kus mRNA koodonitega interakteeruvad mitu tRNA antikoodonit. Kuna koodonid on erinevad, siis järelikult on ka erinevad tRNA'd ja nende küljes ka erinevad aminohappejäägid. Tekib olukord, kus meil on samaaegselt mRNA'ga seotud kaks tRNA'd, mõlema küljes on aminohappejäägid. Kui need tRNA'd on füüsiliselt lähedal selles kompleksis (koodonid asetsevad kõrvuti), siis ka need aminohappejäägid paiknevad üksteisele küllaltki lähedal. Tänu sellele on võimalik nende vahele tekitada keemiline side ­ peptiid side. Valgu süntees ei olegi midagi muud, kui nende peptiidsidemete tekkimise katalüüsiprotsess. Hakkab moodustuma üha kasvava pikkusega valgu ahel, mis on kinnitunud viimasena sisenenud tRNA külge. Järgmise tRNA sisenemisel katkeb side eelmise tRNA ja aminohappejäägi vahel.
Ribosoom on n.-ö ensüüm, mis tekitab peptiidsidemeid aminohapet vahele. Prokarüootne ja eukarüootne ribosoom erinevad üksteisest teatud määral, üldistelt omadustest on nad küllaltki sarnased. Funktsionaalne ribosoom koosneb kahest subühikust, mida kutsutakse suureks ja väikeseks subühikuks, mis omakorda koosnevad erinevatest valgumolekulidest ja rRNA molekulidest. Ribosoomi aktiivsait, ehk siis koht, kus leiab aset uute peptiidsidemete teke, paikneb suure ja väikese subühiku piirpinnal. Struktuur on umbes nii suur, et sinna mahuks korraga üheks nukleotiidi (kolm koodonit). tRNA'd suudavad olla interaktsioonis mRNA'ga ainult siis, kui see toimub ribosoomi sees. Aktiivsaidis eristatakse erinevaid kohti. A- sait (aktseptorsait): see koht, kus aminoatsüleeritud-tRNA'd sisenevad ribosoomi. A-saidi kõrval on P-sait (peptidüül-transperaasne-sait): toimub peptidüül transperaasne reaktsioon ­ toimub peptiidsideme teke. tRNA siseneb A- saiti, kulutatakse energiat, ribosoom nihutab temas olevat mRNA'd ja selle küljes olevaid tRNA'sid ühe sammu võrra tagasi, selle liikumise käigus moodustatakse peptiidside. A-sait vabaneb ja sinna saab siseneda uus tRNA. Eelmine tRNA hakkab ribosoomist väljuma ja liigub E- saiti ( exit -sait) ja visatakse ribosoomist välja. (Suur ja väike subühik saavad omavahel kokku ainult siis kui nendega koos on ka mRNA molekul ).
Kuidas valgusüntees algab ja lõppeb? Valgusünteesi alustamiseks on vaja stardikoodonit (AUG). Stardikoodon ei asu kunagi mRNA 5' otsas esimesel kolmel nukleotiidil, reeglina 100-200 nukleotiidi otsast eemal. Kõige esimese asjana peab ribosoom stardikoodoni üles otsima , seda protsessi nim skanneerimiseks (iseloomulik eukarüootidele) /skanneerimisprotsessis on väike subühik juba interakteerunud tRNA'ga, mis kannam Metionini aminohappejääki/. Seda ei teosta täisfunktsionaalne ribosoom, vaid ribosoomi väikene subühik koos abivalkudega ­ translatsiooni faktorid , mis protsessi reguleerivad. Kui AUG on leitud, siis tänu translatsiooni (initsiatsiooni) faktoritele paigutub väike subühik selle AUG koodoni suhtes selliselt , et temaga kaasas olev tRNA jääb moodustuva ribosoomi P-saiti. Nüüd siseneb kompleksi ribosoomi suur subühik ja algab valgusüntees nagu eelkirjeldatud. /faktorid, mis suunavad mRNA'd läbi ribosoomi kutsutakse translatsiooni ejakulatsioonifaktoriteks/. Süntees lõpetamiseks on vaja stoppkoodonit (UAG, UAA või UGA), millele ei vasta ühtegi aminohapet, seega pole ka vastavat tRNA'd. Kui ribosoomi A-saiti satub stoppkoodon, siis süntees peatub ja ribosoomi sattub tRNA'le sarnane valgu molekul ­ terminatsioonifaktor ( release factor). Kuna mRNA edasiliigutamise vältimatuks eelduseks on peptiidsideme teke ja seda enam saavutada võimalik ei ole, siis ribosoom lihtsalt laguneb, kuna ei suuda oma funktsiooni enam täita. Valgusüntees on lõppenud. Ühte ja seda sama mRNA'd kasutavad mitu ribosoomi.
08/10/09 /.../Kuidas ikkagi elu tekkis? Meil on viirused , mis talletavad pärilikkusinfot RNA'l. See viitab sellele, et kunagi koosnes elu RNA ja valgu molekulidest. Kui Tom Chech avastas ribosüümi (katalüütilise RNA), siis sõnastas ta RNA-maailma hüpoteesi: kui RNA võib samuti omada katalüütilist aktiivsust, siis võib elu algust ettekujutada selliselt, et tekkisid katalüütiliste omadustega RNA molekulid, mis lisaks muudele katalüütilistele omadustele, ilmselt omasid nad ka võimet RNA molekuli pealt sünteesima teist, talle komplementaarset RNA'd. Kuna RNA on suhteliselt ebastabiilne, siis ilmselt hakati säilitama infot RNA koopia (DNA) kujul. (petiidsideme teket katalüüsib samuti RNA).
SUHKRUD
08/10/09 Monosahhariidide peamiseks ülesandeks on energeetiline. Glükoos lõhutakse mitokondrites, selle käigus tekivad sellised ühendid, mis pakuvad hingamisahelale kõrge nivootasemega elektrone ja nende abil sünteesitakse kokkuvõttes ATP. On ka muid ülesandeid. Polüsahhariidid koosnevad monosahhariididest kui monomeeridest. Loomarakkudes võidakse glükosiidsidemetega polümeriseerida glükoosi, millega moodustub polümeer glükogeen, taimerakkudes polümeriseeritakse glükoos tselluloosiks. Tselluloos on kõige olulisem struktuurne polümeer taimedes. Rakkudes on võimalik leida vähemalt 8 erinevat monosahhariidi, neid võime omavahel polümeriseerida. On olemas selliseid polüsahhariide, mis on hargnenud molekul, kus lisaks lineaarsetele üksteise kõrvale polümeriseeritud suhkrujääkidele kõrvale on tekkinud teiste keemiliste sidemete abil hargnenud külgharud. Golgi kompleksis pannakse tihti valkudele külge selliseid suhkrujääke, mis on väga tihti hargnenud molekul. See, et sahhariid on hargnenud molekul välistab selle, et polüsahhariid võiks olla näiteks geneetilise info kandjaks . Polüsahhariidi monomeeride vahel on erinevad sidemed, mida ka sünteesivad erinevad ensüümid.
2 TTÜ | MIHKEL HEINMAA | SÜGIS MMIX MEMBRAAN
15/10/09 Membraanid on struktuurid , mis piiritlevad kõiki elusaid rakke. Palju membraane on võimalik leida ka raku seest ­ piiritlevad enamikke organelle. Membraan koosneb lipiididest . Miks koosnevad membraanid just lipiididest? Lipiidid on dualistlike keemiliste omadustega molekulid: neid iseloomustavad ühelt poolt hüdrofoobne tagaosa (ei lahustu vees) (selle osa moodustavad rasvhappejäägid) ja hüdrofiilne osa (võib moodustuda erinevatest molekulidest). Membraanide moodustamiseks on see hea, sest molekulid paiknevad korrapäraselt (hüdrofoobsed sabaosad on koondunud üksteise poole) ja moodustavad veevaba lokaalse keskkonna. Selline struktuur ( mitsell ) on püsiv. Võib moodustada ka selliseid struktuure, kus hüdrofoobsed sabad on pööratud üksteise poole, hüdrofiilsed pead on pööratud vesikeskonna poole ja molekulid üksteise järel. Kord tekkinud nad enam ei lagune ilma suurt hulka energiat rakendamata. Bioloogiline membraan peab olema nii stabiilne, et see püsiks ilma energiat rakendamata ja teiselt poolt peab ta võimaldama ainete transporti läbi membraani ja peab olema väga dünaamiline, et rakk saaks liikuda ja kasvada. See dualistlik olek tagabki, et struktuur on stabiilne ja dünaamiline. Kui lipiidi molekulid omavahel kohti vahetavad või molekul pöörleb ümber oma telje, siis energeetilisi barjääre ei rikuta ja võimaldab dünaamilisuse.
Bioloogilistesse membraanidesse võivad sisenenda ka muud molekulid, eeldusel et neil on samad keemilised omadused (hüdrofiilse pea ja hüdrofoobse sabaga). Näiteks kolesterooli molekul, mille hüdrofiilse pea moodustab polaarne hüdroksüülrühm, hüdrofoobne saba hetrotsüklist, mille küljes ripub rasvhappe jääk. Kui selline molekul siseneb membraani, siis väheneb sellega dünaamilisus. Kolesterooli tüüpi molekulid on üheks võimaluseks, millega membraani dünaamilisust reguleerida, seega elutähtsalt vajalikud. Kui kolesterooli on liiga palju, siis muutuvad membraanid liiga jäigaks. Kuidas pääsevad hüdrofiilsed ained läbi membraani, kui seal vahel on hüdrofoobne ala? Membraanid ei koosne mitte ainult lipiidest kaksikkihist, vaid sellesse kaksikkihti on sisenenud erinevad valgud. Mõned on kinnitunud membraani külge, mõned liiguvad läbi membraani nii et valgu üks ots on ühel pool membraani ja teine ots teisel pool või nii, et valgu polüpeptiidahel käib mitu korda läbi membraani. (meil on vees lahustuvaid polaarseid aminohappeid ja vees mittelahustuvaid hüdrofoobseid aminohappeid) Kui üks valgu molekul pärast seda kui ta pärast translatsiooni kokkupakitakse siis tehakse seda nii, et hüdrofoobsed aminohappejäägid pannakse molekuli sisse ja pinnale jäävad hüdrofiilsed. Mõnede valkude puhul on nende aminohappeline koostis selline, et neid ei õnnestu selliselt kokkupakkida, on terved piirkonnad valgus, mis koosnevad eelkõige hüdrofoobsetest aminohappejääkidest. Neid ei õnnestu sisse pakkida . Sellised valgud paigutatakse sellisesse keskkonda, kus hüdrofoobsed aminohappejäägid satuvad veevabasse keskkonda ­ membraani. Võib olla nii, et muidu hüdrofoobse piirkonna sisse tekkib kanal. Läbi selle kanali saavad liikuda hüdriilsed ained. Valgu molekulid tagavad niisiis iga konkreetse membraani spetsiifilisuse .
KLONEERIMINE
15/10/09 Restriktaasid on ühed valgulised ensüümid, sellised ensüümid, mis lõikavad katki DNA'd. Nukleiin happeid lagundavad üldiselt sellised ensüümid nagu nukleaasid. Rakkudes on palju erinevaid nukleaase, mis lõhuvad fosfodiestersidemeid. RNA'd lõhub ribonukleaas ja DNA'd desoksüribonukleaas ja on olemas ebaspetsiifilisi nukleaase, mis lõhuvad nii RNA, kui ka DNA ahelaid. Kõikidel tuntud nukleaasidel oli üks ühine omadus: nad lõhkusid fosfodiestersidemeid järjestusest sõltumata. Seetõttu ei olnud võimalik katki lõigata spetsiifilisi lõike. Kuuekümnendate aastate lõpus Smith, Johns Hopkins (???) avastasid bakterirakkudest veel ühed desoksüribonukleaasid, mis erinesid senituntutest, sest need ensüümid lõhkusid DNA'd järjestus spetsiifiliselt. See tähendab seda, et kui me teame mingi geeni nukleotiidset järjestust, siis valides sobiva järjestuspetsiifikaga restriktaasi saab teha katkuse ühelt poolt geeni ja teiselt poolt teise restirktaasiga. Bakterite jaoks on tegemist sisuliselt kaitsemolekulidega: eukarüootses maailmas nukleiinhapete omavaheline vahetamine on sisuliselt võimatu ja ainuke viis on sugulisel paljunemisel, prokarüütses maailmas on tavaline, et prokarüootsed rakud vahetavad üksteisega DNA fragmente. Bakteritel on vaja mehhanismi, kuidas eristada üksteisest oma enda DNA'd ja võõr-DNA'd, selle jaoks ongi olemas restriktaasid. Seega on erinevatel bakteriliikidel on restriktaaside äratundmisjärjestused erinevad.
Kui on meil restriktaasi poolt läbi lõigatud DNA lõik katseklaasis ja lisada sinna teine DNA ja lisada ensüüm ligaas , mis uuesti moodustab fofodiestersidemed. Moodustub uus DNA molekul ­ rekombinantne DNA.
22/10/09 Restriktaaside abil on niisiis võimalik DNA'd lahti lõigata ning DNA fragmente on katseklaasis võimalik ensüüm ligaasi abil kokku liita. Ligaas ei liida kokku kõikki molekule, seega pole see protsess 100%lise efektiivsusega. Kui sobiv molekul tekib, siis peab olema võimalus selle paljundamiseks.
Bakteri rakkudes esinevad kromosoomi kõrval veel ühed DNA molekulid, mille suurus on oluliselt väiksem kui kromosoomil ­ plasmiidid . Plasmiidid on bakteritel olemas enamasti siis, kui ta kasvab suhteliselt mittesoodsates tingimustes, kus võivad sattuda erinevate toksiinide mõju alla vms. plasmiidides sisalduvad geenid enamasti kodeerivadki looduses just taolisi valke, mis on vajalikud ebasoodsates keskkonnatingimustes toime tulla. Geenitehnoloogias on plasmiidid olulised, sest esiteks on nad suhteliselt väiksed DNA molekulid, seega on nendega katseklaasi manipulatsioone lihtsam teha. Teiseks on plasmiidset DNA'd rakus palju ja lihtne bakteritega paljundada.
Seega teeme ühest plasmiidist bakterite abil baktereis palju identseid koopiaid ­ kloone. Kui meil on suured DNA molekulid tuhandete geenidega , milledest paljudel teame nukleotiidset järjestust js sellest aminohappelist järjestust valgus, kuid see ei ütle midagi, mida see
3 TTÜ | MIHKEL HEINMAA | SÜGIS MMIX valk organismis teeb. Et teada saad valkude funktsioone peame võtma geeni tema tavapärasest kontekstist välja, et teda siis võõras taustas uurida. Me võime kloonitud DNAsid kasutada praktilistel eesmärkidel, seda geneetilise koodi universaalsuse tõttu. Kui plasmiidi sisestada inimese geen ja sisestada see tagasi bakteri rakkus, siis hakatakse ka selle inimese geeni pealt transkribeerima mRNA'd. Siis hakkavad bakteri ribosoomid sünteesima selle mRNA pealt valke ja need valgud on täpsed samad, mis oleks tehtud inimeses. Plasmiidid looduslikult on bakterirakkudes, seega on kloneeritud järjestused otstarbekas viia bakterirakkudesse, aga pmst võib viia ka teistesse rakkudesse. Kui näiteks selline plasmiid sattub näiteks imetaja raku tuuma, siis tuumas hakkab ta käituma nagu iga teine DNA molekul. Kuid raku jagunemisel plasmiidi ei paljundata. Väga paljude eukarüüotsete geenide puhul, pärast seda, kui selle geeni pealt on valmis sünteesitud RNA, siis RNA ei ole mitte koheselt ,,küps", et teda oleks võimalik koheselt ribosoomides transleerida. Enne seda tuleb RNA'st mingisugused jupid, lõigud välja lõigata (splaising?). Sellisel juhul muutub DNA kloonimine sisuliselt võimatuks, sest bakterites sellist väljalõikamise mehhanismi ei ole. Mida teha? Retroviirused sünteesivad ensüümi pöördtranskriptaas ­ kasutab matriitsina RNA'd ja sünteesib sellele vastava DNA koopia. Seda retroviiruste ensüümi saab ära kasutada. Kui tahame kloonida rekombinantse valgu tootmiseks bakteris mingit sellist eukarüootset geeni, mida tavapäraselt splice'takse, siis ei alusta kloonimist sellest, et isoleerime geeni ja integreerime geeni mingisse plasmiidi vaid alustame sellest, et puhastame rakkudest vastava geeni pealt sünteesitud ja juba ära splicetud mRNA. Nüüd katseklaasis kasutades pöördtranskriptaasi sünteesime sellele mRNA'le ühe kaheahelalise DNA koopia. Seda koopiat kutsutakse sidiDNA'ks (?). Ja kõik jätkub endisel viisil.
05/11/09 Erinevad bakterid sünteesivad erinevaid restriktaase, erinevatel restriktaasidel on järjestusspetsiifika. Kui tahame kindlat lõiku DNA'st, siis valime sellise restriktaasi, mis lõikab katki sobivaid järjestusi. Kuidas me teame DNA nukleotiidset järjestust? Sequencing ­ sekveneerimine. DNA nukleotiidse järjestuse väljaselgitamise meetodi mõtles välja F.Sanger. metoodika baseerub sellel, et Sanger võttis kasutusele nn modifitseeritud nukleotiidid. /ribonukleotiidis on nii 3' positsioonis ja 2' positsioonis on riboosi jäägi küljes OH rühmad, desoksüribonukleotiidis on hapnik puudu 2' positsioonist puudu. OH rühm on vajalik fosfodiester sidemete moodustamiseks./ Modifitseeritud nukleotiidil puudub OH rühm ja ahela polümeriseerimine sellest nukleotiidist edasi ei ole võimalik. Seda didesoksüribonukleotiidi saab ahelasse lülitada seepärast, et 5' positsioonis oleva süsiniku juures olevad fosfaatrühmad, mis moodustavad keemilist sidet, seega saab seda nukleotiidi panna eelmise normaalse nukleotiidi otsa, kui järgmist lülitada pole võimalik, kuna puudub vaba 3' hüdroksüülrühm. Oletame, et sünteesime in vitro uut DNA ahelat . Katseklaasis peavad olema DNA polümeraas (ensüüm), matriits DNA, nukleotiide ((dATP, dCTP, dGTP, dDTP)= dNTP). Kujutame, et neljas katseklaasis segame kokku sama lahuse. Oletame, et paneme esimesse natukene näiteks didesoksüATP'd. Sünteesuvad lühemad ahelad , millede lõppu me teame antud juhul A. // Elektroforees . Geel on klaaside vahel, geeli peale võime proove kanda, näiteks DNA'd. Pannes geeli elektrivälja, siis teatud ( omades laengut) juhul võivad molekulid läbi geelis olevate pooride teise elektroodi poole. Kõik nukleiinhapped hakkavad läbi geeli seega elektroodi poole liikuma. Kui proovis on erinevaid nukleiinhappemolekule, siis pikema ahelaga molekulid liiguvad aeglasemalt kui lühemad. Nii saame ahelaid üksteisest eraldad sõltuvalt nende suurusest //. Sandler pani katseklaasides sünteesitud ahelad geelile ja lahutas nad. (mingi radade jama ).
POLÜMERAASI AHELREAKTSIOON - PCR
12/11/09 Garry Mullis sai Nobeli preemia selle meetodi väljatöötamise eest. DNA sünteesi reaktsiooni jaoks oli vaja DNA polümeraasi (ensüümi), matriits-DNA, dNTP (4). Tegelikult sellisel kombel reaktsiooni ei toimu. Puudu on praimerid (lühike DNA lõik). DNA polümeraas ei suuda hakata nullist DNA ahelat sünteesima, küll aga olemasolevat ahelat pikemaks tegema. Denatureerides (lahti keerutades) kaheahelalist DNA molekuli temperatuuri toimel saame kaks üheahelalist DNA molekuli. Lisades nüüd katseklaasi sobivaid praimereid, suudab polümeraas sünteesida uue ahela ja saame kaks kaheahelalist DNA molekuli.
Esimese tsükli alguses DNA proov toatemperatuuril. Tahtes ahelaid lahku viia tuleb proovi tõsta ~100 o ni. Tahtes praimerite seondumist DNA üksikahelaga tuleb proovi jahutada ~50o juurde. Tahtes DNA'd sünteesida tuleb temperatuuri veel alandada. Järgmises tsüklis tahtes DNA'd sünteesida, siis see ei õnnestu, kuna polümeraas ei tööta (denatureerinud kuumuses), seega on vaja iga kord polümeraasi juurde panna. Mullis hakkas puhastama DNA polümeraase kuumaveeallikatest isoleeritud bakteritest. Kasutades sellist polümeraasi, pole vaja temperatuuri alandada (pigem tõsta) ja esimese tsükli lõpus enam uut polümeraasi lisama ei pea. Sedasi saab väga väikesest DNA proovist teha sedasi paljundades piisav hulk.
ÜLDISED BIOKEEMIA MEETODID
12/11/09 Tsentrifuug. Nukleiinhapped lahustuvad vees, kuid mitte alkoholis. Seega kui lisada raku ekstraktile piisaval koguses näiteks etanooli, siis suur osa vesilahustuvatest rakukomponentidest lahustub alkoholis ja jäävad vedelasse faasi, aga nukleiinhapped sadenevad välja. Katseklaasi tsentrifuugi pannes tahke faas liigub kiiresti katseklaasi põhja ja saame suhteliselt puhta nukleiinhappefraktsiooni. (valgud ei lahustu näiteks atsetoolis ja saab teha pmst sama asja). Võttes ühe rakulüsaadi, kus on igasuguseid asju, üksikuid vesilahustuvaid molekule, ioone, soolamolekule, aga ka palju suuremaid struktuure. Nii on katseklaasi palju terveid organelle, ribosoomide sub-ühikuid ja muid asju erineva suuruse ja tihedusega elemente. Hakates sellist segu tsentrifuugima, siis väikestel kiirustel väga suured ja tihedad asjad lähevad
4 TTÜ | MIHKEL HEINMAA | SÜGIS MMIX katseklaasi põhja, kõik ülejäänu hulbivad edasi. Suurendades tsentrifuugi kiirust ja aega, siis õnnestub vaikselt põhja viia üha väiksemaid ja üha vähem tihedaid struktuure.
19/11/09 Kromatograafia . Mihhail Tswett uuris taime pigmente, mis on teatavasti eri värvusega molekulid. See võimaldas Tswettil välja töötada metoodika, mis võimaldas värvilisi molekuli üksteisest eristada. Tänapäevases kromatograafias ei lahuta me ainult värvilisi molekule, kuid meetodi nimi on jäänud alles. Tswett võttis ühe lehe, mis võis koosneda tselluloosist, aga võis ka mingisugusest muudest ainetest. Selle lehe ühte punkti pipeteeris väikese tilga mingisugust taime ekstrakti . Tswetti küsimus oli, kas selles koetükkis, millest ta selle ekstraki tegi, on üks konkreetne pigment , või palju erinevaid. Vastu leidmiseks pani ta prooviga ja kuivanud lehe otsapidi mingisugusesse orgaanilisse lahusesse. Piki paberit tekib vee vool kapillaarjõu mõjul. Voolu käigus jõuab vedelik proovini ja nüüd on kaks võimalust: kas selles proovis on selliseid andeid, mis ei lahustu ­ sellisel juhul jäävad nad kohale, kuhu nad pipeteeriti; või nad lahustuvad lahustis ja hakkavad koos lahustiga liikuma mööda seda lehte. Nende liikumiskiirus sõltub nende molekulide suurusest. Lõppkokkuvõttes oleme ühest proovist saanud (neli) erinevat signaali. Katse tulemusena ta ütles, et selles proovis on vähemalt (neli) erinevat pigment. ,,Vähemalt" seepärast, et ühes laigus võib erinevaid pigmendi molekule olla rohkem kui üks, aga neil kõigil üks omadus, et nad ei lahustu antud lahuses. Nüüd võis selle sama proovi kanda uuesti paberile ja voolutada mingi teise lahustiga ja võrrelda tulemusi omavahel ja puhaste pigmentidega. Tänapäeval on selline tegevus muutunud üheks kromatograafia eriharuks, mida nimetatkse TLC'ks ( Thin Layer Chromatography). Kui uuritakse mingeid muid aineid, mida pole võimalik silmaga otseslt visualiseerida, siis võime need molekulid teha näiteks radioaktiivseks ja pärast paberile pannes rontgenfilmi, saame me jälle neid näha. Tänapäeval on kromatograafiast palju erinevaid variante tekkinud. Bioloogia laboris on võib-olla kõige olulisem alaliik, mida tavaliselt kutsutakse kolonn -kromatograafiaks. Tegemist on kolonniga, katseklaasiga, mille põhjas on auk. Kolonn on täidetu poorse ainega (nagu geel). Vedel proov kantakse kolonni. Täiendavat jõudu rakendamata hakkavad proovis olevad molekulid liikuma läbi kolonni allapoole raskusjõu mõjul. Liikumiskiirus kolonnis sõltub molekulide suurusest, kusjuures suuremad molekulid liiguvad kiiremini. Seega on erinevate molekulide liikumiskiirus kolonnis erinev ja kui hakkame läbitulevaid proovi tilkasid koguma ja kogume neid erinevatesse katseklaasidesse, siis ühte katsekalaasi saame suuremad molekulid ja väiksemad molekulid saame puhtal kujul koguda järgmisesse katseklaasi. Erinevus TLC seisneb selles, et TLC's ei saa ainet peale kanda väga palju ja pole võimalik teha ainega edasisi katseid, kuna see on paberi sees. Siin aga on kogutud enamvähem puhas aine katseklaasi ja edasised katsed on võimalikud. On selge, et paljud molekulid, mille bioloogiline tähendus on erinev võivad oma üldsitel füüsikalis- keemilistel olla väga sarnased. Tavalise geelkromatograafia abil neid üksteisest puhastada ei saa. Andes kolonnidele mingeid erilisi omadusi on see siiski võimalik. Andes geeljale ainele elktrilaengu, siis kolonnist liiguvad läbi ainult need molekulid, millel on vastav laeng. Nüüd saame eristada molekule mitte ainult nende suuruse vaid ka laengu järgi ­ ioonivahetus kromatograafia. Afiinsuskromatograafia puhul on kolonn täidetud geeliga, millel on väga spetsiifilised omadused. /Dna polümeraas seondub igal juhul DNA'ga. Oletame, et teeme kromatograafilise eksperimendi, aga selle kolonni täiematerjali kulge seondame üheahelalise DNA molekuli. Pannes kolonni peale segu erinevatest ainetest, mis rakust saime, siis kõik molekulid jooksevad kolonnist läbi, kuid DNA polümeraas jääb kolonni kinni, kuna ta seonudus DNA'ga. Nüüd võime hiljem pipeteerida kolonni puhvrit, millel on näiteks väga aluseline või väga happeline pH, siis loome mittelooduslikud tingimused, kus polümeraas pole võimeline DNA'ga seonduma. Nüüd jookseb kolonnist läbi (puhas) DNA polümeraas/. Sellist geeliga kolonnkromatograafiat nimetatakse Liquid Chromatography'ks. Avaldades kolonnile survet (rõhku), siis nim seda HPC'ks (High Pressure liquid Chromatograpy'ks). HPC puhul saab sisuliselt väga keerulisest segust erisatda suvalisi molekule.
Elektroforees on sisuliselt kromatograafia edasiarendus. Tänapäeval kasutame üldjuhul sellised plaat-elektroforeesi masinaid, et saaks korraga palju prove üksteise kõrvale kanda, siis põhimõtteliselt võime ka kolonni rakendada elektrivälja. /vaadata meetodi kohta sekveneerimise juures/. Kõik nukleiinhapped on alati negatiivse laenguga, seega liiguvad alati +elektroodi poole. Valgu molekulidel võivad olla erinevad laengud , sest erinevatel aminohapetel on erinevad laengud, mis annavadki erineva iseloomu, on olemas selliseid aminohappejääke, mis annavad negatiivseid ja positiivseid laenguid ja ka neutraalseid. Tahtes valgumolekule elktroforeetiliselt üksteisest lahutada, siis tehes foreesi, siis negatiivse summarse laenguga valgud hakkavad separeeruma, kui neutraalsed ennast ei liiguta ja positiivsed liiguvad läbi puhvri elektroodi poole ja me kaotame nad. Seepärast valkude analüüsimisel kasutatakse sellist nippi: kõik valgumolekulid, mida me tahame analüüsida segatakse kokku sellise ainega, mille ingliskeelne lühend on SDS, sellel ainel on endal negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule. Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule endale iseloomulik laeng tähtsust enam ei oma. Elektroforeesil hakkab kogu kupatus liikuma positiivse elektroodi poole. Kuidas me valgumolekule ikkagi näeme skeemil ? Me võime in vitro nukleiinhappeid sünteesida radioaktiivsetena ja siis saame neid geelis visualiseeirda. Lisaks sellele, et võim visualiseerimiseks teha molekule radioaktiivseks, võime neid segada kokku ainetega (näiteks fluoritseeruvate), mis spetiifiliselt seonduvad nende molekulidega. Veel valkude nähtavaks tegemisest. Antikehad on valgud, mis seonduvad antigeenidega ja märgistab selle, et kaitserakud (n makrofaagid) selle hiljem ära tunneks. Organismil on võimalik toota trillioneid erinevaid antikehasid, seega ükskõig millele, eeldusel, et see on kehavõõras. Äratundmis spetsiifika on äärmiselt kõrge. Kui meil on valgumolekulid, siis ükskõik millise nende molekuli vastu, kui meil on olemas antikeha , siis me võime värvida või hübridiseerida seda geeli konkreetse antikehaga, siis antikeha seondub selle valgu molekuliga, mida ta ära tunneb. Kui antikeha ise oli märgitud fluoriseeruva ainega, siis nüüd on valk näha. Neid kõikvõimalike antikehasid toodavad meile hiired. Et neid vajalikke antikehi teistest eraldad, siis teeme sellise kolonni, kus meil see antigeen on seotud kolonni ja katselooma seerum lastakse kolonni ja vajalikud spetsiifilised antikehad seonduvad antigeeniga.
5 TTÜ | MIHKEL HEINMAA | SÜGIS MMIX 03/12/09 Blottimine, hübridiseerimine. Eelkõige nukleiinhapete uurimisel . Hübridiseerimine on meetod, mis võimaldab nähtavaks teha, enda jaoks, in vivo olevaid molekule ­ molekule, mis pole sünteeside käigus märgistatud. Nukleiinhapete märgistamine: kuskil on nukleiinhappe ahel, kui me teame millise järjestusega nukleiinhapet me otsime , siis peame omama otsitavale komplementaarset järjestust. On elektroforeesi geel, kuhu oleme lauhtanud mingisugused nukleiinhapped. Kõikkide radade peal on tuhandeid erinevaid nukleiinhapete molekule ­ neid on nii pelju, et me ei erista neid üksteisest. Esitame küsimuse, et kas nende molekulide hulgas on konkreetne molekul, millel see järjestus, mis meid huvitab . Esiteks peame geelis olevad nukleiinhapped kätte saama nii, et nad oleksid endiselt üksteisest separeeritud. Selleks saame võtta selle geeli ja panna sellel ühe lehe ­ filtri , nailonist (mis seob hästi nukleiinhappeid). Nukleiinhapped liiguvad geelist välja ja jäävad filtrisse kinni (seda vedeliku geelist läbijuhtimisel). Filtri külge jäänud nukleiinhapped on nüüd üksteisest separeeritud ja tahkel kandjal. Nüüd paneme filtri mingisugusesse puhvrisse (vedelikku), kuhul lisame otsitvale järjestusele komplementaarseid nukleiinhappeahelaid. Lisatud komplementaarsed ahelad on kuidagi eelnevalt katseklaasis märgistatud. Kui märgistatudud ahelad vedelas puhvris hulpides leiavad komplementaarse otsitava ahela, siis jääb see sinna kohale filtrile kinni. Võtame filtri lahusest välja ja peseme puhtaks ja paneme peale rüntgenfilmi ja ilmneb soovitud band. Seda protsessi, kus nukleiinhapped kantakse geelilt üle filtrile nimetatakse blottimiseks. Kui geelis ei ole separeeritud nukleiinhappe molekuid vaid valgumolekulid, siis saab ka neid filtrile üle kanda. Kuid hübridiseerimisel tuleb kasutada komplementaarsete nukleiinhapete ahelate asemel spetsiifilisi antikehi. Meetodi välja mõtleja oli Ed Southern , kes demostreeris seda DNA'ga. Õige varsti demostreerisid teised inimesed seda sama RNA puhul. DNA hübridiseerimist hakati selle mehe järgi kutsuma southern blotting. RNA hübridiseerimist hakati kutsuma northern blottinguks. Valkude hübridiseerimist nimetatakse western blottinguks.
TRANSGEENSED ORGANISMID
03/12/09 Transgeenne on organism siis, kui tema kromosoomi on viidud teisest liigist organismi geene ja need päranduvad järglastele. Kui me tahame teha GMO'd, siis peame mõtlema sellele, kuidas oleks võimalik seda DNA'd viia niiviisi rakkudesse, et see järjestus oleks esindatud ka sugurakkudes. Imetajate tegemisel näiteks viime võõra DNA otseselt viljastatud munarakku, nii on hiljem järjestus esindatud kõikides organismi rakkudes. Munarakk hakkab jagunema , tekib embrüo, mille kõik rakud sisaldavad võõrast geeni. Hiirel sünnivad järglased ja üks neist sisaldab oma kõikides rakkudes võõrast järjestust. Teine võimalus. Väga varajase embrüo puhul räägime moorula staadiumist, kus kõik selle embrüo rakud on samaväärsed, ei ole defineeritud millise koe rakud neist saavad. Esimese diferentseeumise sündmus on blastotsüsti moodustumine, kus on eristunud kaks raku tüüpi: väline rakukiht (tropoektoderm) ­ need rakud, millest ei moodustu embrüo ise vaid platsenta, teine tüüp on sisemine rakumass, millest moodustub embrüo, aga rakud seal pole endiselt diferentseerunud. Me võime võtta blastotsüsti staadiumis sisemise rakkumassi rakud ja panna nad koekultuuri kasvama ­ embrüonaalsed tüvirakud. Nendesse rakkudesse on hõlbus viia võõrast DNA'd. Nüüd võime võtta teise plastotsüsti ja süstida transgeensed blastotsüstid sinna. Nüüd on selles blastotsüstis kahte tüüpi rakke. Sünnib hiir, mis on kimäär, mis tähendab, et osad koed on transgeensed, osad mitte. Kui sugurakud kujunevad transgeensetest rakkudest, siis järgmises põlvkonnas saame tõelise heterosügootse trangeense looma. Transgeensete taimede tegemine on lihtsam. Täiskasvanud taime rakkud on säilitanud totipotetnsuse, seega ei pea lähtuma embrüogonaalsetest rakkudest.
Selliseid hiiri tehakse enamalt jaolt selleks, et uurida erinevate geenide funktsioone. Transgeneesi käigus võib juhtuda, et võõras järjestus lihtsalt integreerub kuhugi (mittehomoloogiline rekombinatsioon ) või asendab spetsiifilisse kohta ­ asendab sarnast järjestust (homoloogiline rekombinatsioon). Nüüd ei ole viinud järjestuse täiendavalt juurde. Selliseid organisme, kus järjestus on asendatud nimetatakse nokaut organismideks. Mõlema protsessi korral võivad tagajärjel tekkival organismil praktilised omadused. Näiteks nokaut organisme võib kasutada haiguste uurimisel põhjustatud geenimuutustest.
17/12/09 Lammas Dolly . Dolly oli esimene kloonitud imetaja. Dolly kloonimisega tõestati, et kõikides organismirakkudes on samasugune genoom, kõik geenid. Võeti munarakk ja eemaldati sellest rakutuum koos kogu selles sisalduva infoga . Võeti teise individi suvalise (mittesuguraku) diploidse raku tuum ja kanti üle esimesse munarakku. See munarakk võiks hakata nüüd jagunema, eeldusel, et seal sisaldub kogu vajalik informatsioon. Dolly sündimine näitas, et see on võimalik.
GEENITERAAPIA
17/12/09 Kui selgub , et indiviidil on mingisugune geneetiline defekt , siis pole seda võimalik ravida transgeensete meetodite abil. kui tahetakse mingitesse teatud rakkudesse viia täiendavat geneetilist informatsiooni, siis seda saab suhteliselt hõlpsasti teha viirustega. Viies normaalse geeni viiruse koosseisu ja nakatada rakku selle viirusega, siis on meil lisaks defektsele geenikoopiale ka normaalne ja rakk ravitakse terveks. Kuid kehas on miljardeid rakke ja viirusega tuleb saada pihta õigele rakule. Kui viirus viib normaalse geeni valedesse rakudesse, siis pole sellest haiguse ravis mingit kasu või toob hoopis kahju. Viirused viiakse rakkudesse spetsiifiliste retseptorite abiga. Viirused on evolutsiooni käigus muutunud sarnaseks rakkude vahel liikuvate signaalmolekulidega ja rakk seob siis ekslikult selle viiruse. Me võime võtta viiruse ja eemladad patogeneesiga seotud geenid ja sellisesse ohutusse viirusesse võib viia juurde meid huvitavaid geene ja valides sellise viiruse, mis oma omaduste tõttu on võimeline siseneda konkreetsesse rakku.
6