RAKUBIO PRAKTIKUM eksamiks kordamine (0)

RAKUBIO PRAKS

Apoptoos ja rakutsükkel.
Apoptoos – programmeeritud rakusurm . Põhjuseks võib olla raku vigastus, geneetilised vead vigastusest.
Apoptoos e. kontrollitud raku surm on raku surm, mis on raku enda poolt käivitatud ja kontrollitud. Apoptoosi käigus laguneb rakk väikesteks membraaniga ümbritsetud vesiikuliteks, kusjuures tema tsütoplasma komponendid ei satu ekstratsellulaarsesse ruumi. Nekroos on raku surm, mis ei allu tema enda kontrollile. Selle käigus kaob raku membraani terviklikkus ning tema tsütoplasma komponendid satuvad ekstratsellulaarsesse ruumi, mis võib kahjustada teisi rakke ja põhjustada põletikku.
Hiirtel tekivad nt varbad apoptoosi käigus, apoptoosi teel tekivad varbavahed.
Staadiumid: antakse signaal  see jõuab mitokondrini  tsütokroomC tuleb periplasmast välja, sest kaotab heemi (ilma tsütokroomC-ta jäävad elektronid seisma, tekivad radikaalid)  läbib rida kaspaase (mis on apoptoosi algatajateks ja läbiviijateks)  DNA fragmenteerumine , tekivad väikesed membraaniga ümbritsetud vesiikulid.
Et rakke värvida, peab nende membraan olema kahjustatud, siis PI, DAPI pääsevad sisse. Rakud mis värvuvad on järelikult kahjustunud või surnud (surnud või hilises apoptoosis).
DNA värvid: DAPI, PI, 7AAD.
Fluorestsents – aine omadus neelata kõrgema lainepikkusega footoneid. Kiire protsess (nanosekundite küsimus).
FAS antikeha – annab rakule intensiivsust, väärtuse – läbivoolutsütomeetria. + suhtelised suurused ja granulaarsus. Suurem intensiivsus – rohkem paremat saaki.
G1 – 1kordne genoom .
S – DNA süntees.
PI – seostub RNA-ga  RNAst tuleb lahti saada.
Paljud rakud lähevad G1-st G0 ja seega G1 rohkem rakke.
Ülemised helendavad rohkem.
Immuunofluorestsents.
Aktiinifiibrite ja tuuma visualiseerimine – miks vaja? – 1) valkude paiknemise uurimine raku sees, pinnal ja kudedes. 2) valkude ekspressioonitaseme hindamine (eri rakuliinides ekspresseeruvad valgud erinevas hulgas. 3) erinevate valkude omavaheline paiknemine ja interaktsioonid rakus.
Rakkude fikseerimine – PBSiga (paraformaldehüüd) – rakus olevad valgud ristseotakse lüsiini kaudu – rakk tardub.
Triton-X lahusega jääl – teeb rakumembraani auklikuks (triton-X seob endaga membraani lipiide ). Tulemus: antikehad ja muud elusasse rakku sisenemisvõimetud ühendid pääsevad rakku (falloidoon ja DAPI).
Blokeerimine enne antikehatöötlust – eesmärk on vähendada rakkudes piirkondi, kuhu antikeha võiks mittespetsiifiliselt seonduda (Passiivne adsorptsioon). Blokeerimine toimub valgulahusega (piimapulbri lahus (lõssipulber), veise seeumalbumiini lahu, mõne muu looma seerum).
Primaarne antikeha – antikeha, mis on toodetud kindla valgu, peptiidi, kabohüdraadi vms vastu.
Sekundaarne antikeha – antikeha, mis on toodetud kindlast organismist pärit antikehade vastu. Enamasti seotud fluorokroomidega.
Epitoop – antikeha seondumiskoht antigeeni molekulis. Väga spetsiifiline.
Monoklonaalne antikeha – omab vaid üht seondumiskohta e. epitoopi. Spetsiifiline. Vahel ei leia mono -AK oma üht ja ainust epitoopi üles (epitoop varjestatud teiste molekulide poolt).
Polüklonaalne antikeha – tegu on antikehade kloonide seguga, millest iga erinev kloon võib seonduda sihtmärgiga, selle erineva piirkonna kaudu. Erinevaid kloone võib olla varieeruvalt 10-100 nt, igaüht toodab erinev B-rakk.
Funktsionaalsed erinevused monoklonaalsest antikehast: parem tööriist, kui antikeha raskesti ligipääsetav. Suurem risk mittespetsiifiliseks seondumiseks.
Ergastusmaksimum – 488nm DAPI – 350, Alexa Fluor – 488.
Emissioonimaksimum – 530nm. DAPI – 460, Alexa Fluor – 530.
Emissioonfluorestsents filtrid – roheline: 500, kollane: 580, oraanž: 630, punane: 680.
Kromosoomid ja rakutsükkel
Genoom on mitoosi metafaasis kõige kokkupakitum, kõige paremini näha. 2kordne genoom.
1kromosoom = 1DNA molekul. Kromosoomide arv näitab mitu erinevat juppi DNA-d on.
Kromosoomide kuju: kuju annab tsentromeer , kuhu kääviniidid kinnituvad:

• Metatsentriline – kui tsentromeer on keskel.
  
• Submetatsentriline – tsentromeer ühe otsa poole, üks lühike teine pikk õlg.
  
• Akrotsentriline – tsentromeer täitsa ühes otsas. Lühike õlg, otsas satelliidid.
  

Neid kolme tüüpi esineb inimestel ↑

• Telotsentriline – otsas täiesti. (esineb nt lehmadel). Satelliiti pole, nagu akrotsentrilisel.
  

Vöödistuse järgi – töödeldakse ensüümidega :

• G- banding – vöödistus kogu kromosoomi ulatuses
  
• R-banding – (R-reverse) temperatuuriga. Heledad kohad mis G-ga tumedad . Ühesõnaga tagurpigi G-banding.
  
• Q-banding – fluorestseeruv muster. Muster sarnane G-le.
  

Ainult teatud piirkonnad:

• C-banding – tsentromeerid ja heterokromatiin.
  
• T-banding – telomeerid
  
• NOR-värving – tuumakese organisaator piirkonnaga seotud valgud.
  

Kromosoomide grupid:

• A – metatsentrilised, submetad 3 paari. Kõige suuremad.
  
• B – suured sub- meta . 2 paari. Lühikese ja pika õla suhe 1:3.
  
• C – keskmised submeta. Naistel 8, meestel 7.
  
• D – keskmised akrotsentrilised. 3 paari.
  
• E – väikesed submeta. 3 paari.
  
• F – väikesed metatsentrilised (nagu kikilips ). 2 paari.
  
• G – väikesed akrotsentrilised. Naistel 4, meestel 5.
  

Kromosoomide analüüsimiseks parimad rakud on perifeersest verest. Suust ei saa steriilseid rakke, mida analüüsida. Ka on sobiv materjal: nahk, luuüdi, amnionivesi (lootevesi), koorion (varases raseduses 11-12 nädal), loote nabaväädi veri .
Kontrollpunktid, enne analüüsimist:

• Mitogeen (PHA) – kultuuri initsiatsioon. Annab märku, et väljuda G0-st ja minna S-faasi paljunema.
  
• Kolhitsiin (mitoosi inhibiitor ) – kääviniit ei lähe nii pikaks et kinnituda tsentromeerile. Kromosoomid kondenseeruvad kui kaua hoida.
  
• Rakkude hüpotooniline töötlus – KCl, Na-tsitraat.
  
• Rakkude fikseerimine – metanool /jää-äädikas
  
• Kromosoomi preparaadi valmistamine.
  

Polümorfism – mitmekujulisus. Normivariandid.

• Translokatsioon – üks kromosoomi osa (üks ühel pool tsentromeeri, teine teisel pool) liitub teisega tsentromeeri pidi. Kirjutatakse nt t(14;15)(q10;q10)mat – ema poolt esinev translokatsioon 14 ja 15 kromosoomi vahel.
  
• Inversioon – ümberkeerdumine. 2 kromosoom segmendi ümberpöördumine. Kirjutatakse: inv(13)(q14;q22)mat – 13 kromosoomi inversioon, emapoolne.
  
• Deletsioon – osa kromosoomist kaob. Del(22).
  
• Duplikaatsus – osa kromosoomist kahekordistub.
  

Kromosoomhaigused e. Sündroomid:

• Downi sündroom – 21. Kromosoomi trisoomia. 47, XX/XY,+21.
  
• Edwardsi sündroom – 18. Kromosoomi trisoomia.
  
• Patau sündroom – 13. Kromosoomi trisoomia.
  
• Prader -Willi sündroom – seitse geeni 15 kromosoomil on kustutatud või ei ekspresseeru. Vaimse arengu peetus , rasvumine, lihasnõrkus.
  

Sugukromosoomide arvu anomaaliad :

• Turneri sündroom – 45,X
  
• XXY – klinefelteri sündroom. Mees. Need mehed on naiselikud. Tavaliselt ilmneb alles pubeka eas. (47,XXY)
  

• XYY – mees. Agressiivsed, kuna lisa Y krom. – rohkem testosterooni.
  
• XXX – naine. Need naised on mehelikud. (47,XXX)
  
• Triploidia – kõiki kromosoome on 3. III III iii jne. Hukkuvad juba varases raseduses.
  

+mar – marker kromosoom . Võivad tekkida akrotsentriliste lühikestest õlgadest (satelliitidest). Täpike karüotüübil.
Barri kehake , X kromosoomi inaktivatsioon – kõikide emaste imetajate teine X kromosoom kondenseerub ning seal olevad geenid inaktiveeruvad. X-kromosoomi kondenseerumine toimub praktiliselt kõikides emaslooma somaatilistes rakkudes ning see on nähtav rakutuumas tumeda, tuuma membraani läheduses paikneva struktuurina, mida nim barri kehakeseks. X-inaktivatsioon toimub varajases embrüonaaleas. Kumb X-kromosoom inaktiveerub, kas isalt või emalt pärinev, see toimub juhuslikult. X-inaktivatsioon pole siiski täiesti pöördumatu. Meioosi läbimisel reaktiveeritakse kondenseerunud X-kromosoom ning tekkinud munarakkudes on nii isalt kui emalt päritud X-kromosoom võrdselt aktiivsed.
Barri kehake e. Sugukromatiin, emasimetajate keharakkude tuumas paiknev struktuur, mis tavaliselt asub tuuma perifeerias tihedalt vastu tuumamembraani . Sugukromatiini olemasolu/puudumise järgi saab väheste interfaasirakkude mikroskoopilisel uurimisel tuvastada indiviidi kromosoomset sugu. (Esimesed sootestid)
X-kromosoomide arvu anomaaliate puhul on barri kehakesi (inaktiveeritud X-kromosoome) alati ühe võrra vähem kui X kromosoomide arv karüotüübis. Ehk 45,X – puudub. 47,XXY – üks. 47,XXX – kaks.
Metülatsioon – inaktivatsioon
Demetülatsioon – aktivatsioon
- Ootsüüt – demetülatsioon
- Sügoot – metülatsioon
- Moorula – demetülatsioon, mõlemad X-kromosoomid aktiivsed
- Varane blastotsüst – isapoolse X-kromosoomi inaktivatsioon trofektodermis
- Blastostsüsti staadiumis hüpoblasti, primitiivse endodermi ja trofektodermi rakkudes isapoolse X-kromosoomi metülatsioon (inaktivatsioon)
- Hiline blastotsüst – püsib isapoolse X-kromosoomi inaktivatsioon embrüovälistes kudedes, kuid epiblasti (embrüo) rakkudes juhuslik X-kromosoomi inaktivatsioon
- Somaatilistes rakkudes püsib inaktivatsiooni muster kogu elu jooksul
- Ürgsugurakkudes toimub oogoonides juhuslik X-kromosoomi inaktivatsioon
- Meioosi käigus toimub X-kromosoomi XIST-geeni demetülatsioon (aktivatsioon) Meioosi I jagunemise I profaasis
MITOOS:
Interfaas – jaguneb G1, S ja G2. S faasis toimub DNA replikatsioon , histoonide süntees. G1 ja G2 annavad rakule vajaliku aja kasvamiseks.
Profaas – kromatiin kondenseerub kromosoomideks. Lagunevad tsütoplasmaatilised mikrotuubulid ja hakkab tekkima kääviniidistik.
Prometafaas – algab tuumamembraani lagunemine vesiikuliteks. Kromosoomide tsentromeeride külge moodustuvad kinetohoorid.
Metafaas – kromosoomid on reastunud ühele tasapinnale kahe pooluse vahele. Tütarkromatiidid on tsentromeeri abil veel ühendatud.
Anafaas – tütarkromatiidid alustavad poolustele liikumist.
Telofaas – tütarkromatiidid jõuavad poolustele, tütartuumade ümber moodustub uus tuumaümbris, ilmuvad uuesti tuumakesed.
Tsütokinees – moodustub aktiinirõngas, mis asetseb risti kääviniidistikuga, toimub plasmamembraani sissenöördumine, see lõppeb kahe tütarraku eraldumisega.
MEIOOS:
I profaas: leptoteen – algab kromosoomide kondenseerumisega. Iga kromosoom kinnitub oma mõlema otsaga tuumamembraani külge. Sügoteen – algab homoloogsete kromosoomide paardumine . Paardunud kromosoomi osade vahele moodustub valguline struktuur, mis hoiab homoloogseid kromosoome koos. Pahhüteen – toimub krossingover. Diploteen – homoloogid eemalduvad veidi teineteisest, kuid jäävad siiski veel seotuks nendest kohtadest kus toimus ristsiire . Meioos võib peatuda, algab osaline kromosoomide lahtipakkumine, hakatakse sünteesima RNAd ja valke. Diakinees – lakkab RNA süntees, kromosoomid konderseeruvad ja eralduvad tuumamembraanist.
I metafaas: homoloogide paare hoiavad kuni anafaasini koos kiasmid (ristsiirde kohad), mis täidavad sama funktsiooni nagu tsentromeerid mitoosis.
I anafaas: homoloogilised kromosoomid lahknevad poolustele, mis koosnevad 2 tütarkromatiidist. Lahknemine toimub sõltumatult. St et kumbki tütarrakk saab juhuslikult nii isas - kui emasvanemalt pärit homolooge.
I telofaas – kromosoomid jätkavad liikumist poolustele, moodustuvad tuumakatted ja järgneb tsütoplasma pooldumine .
Meioosi esimese poole jooksul moodustub ühest diploidsest rakust kaks haploidset tütarrakku.
Meioosi II osa on analoogiline mitoosiga, erinevuseks on et jagunevad 2 haploidset rakku.
II profaas – kaovad tuumakate ja tuumakesed ning moodustub käävisüsteem.
II metafaas – koonduvad kromosoomid raku keskossa.
II anafaas – kromatiidid lahknevad eri poolustele.
II telofaas – tekivad tuumakatted ja järgneb tsütokinees.
Meioosi lõpuks on tekkinud 4 haploidset tütarrakku.
Lambihari kromosoomid – meioosi I profaasi diploteeni rakkudes
Polüteenkromosoomid – suur kromosoom. Tekivad kui mitu ringi replikatsiooni tekitavad mitu õde kromatiidi ja need jäävad kokku.
Buffid – paksendid kromosoomil.
Balbiani rõngad – lokaalselt despiraliseerunud DNA, kus toimub transkriptsioon .
Esinevad ainuraksetel, taimede endospermi rakkudes, loomadel süljenäärme rakkudes.
Ekdüsoon – süntees pidev kogu eluea vältel.
Praks 4.
Preparaatide fikseerimine:

• Orgaanilised solvendid – eraldavad rakust vee ja membraanidest lipiidid, rakust eralduv vesi asendatakse solvendiga. Etanool, metanool, atsetoon , ksülool, toluool . Atsetoon, metanool – kasutatakse kõige rohkem. Peavad olema külmad, muidu kuivavad kiiresti ja lõhuvad raku. Ksülool ja toluool – lenduvad ja toksilised. Kasutatakse vähem.
  
• Ristseoseid tekitavad ained – seosed tekivad valkude vabade aminorühmade kaudu. Tekitab ristseoseid erinevate valkude või valguosade vahel. Ei lähe sisse antikehad ega värv. Formaldehüüd, paraformaldehüüd, glutaaraldehüüd; formaliim (37% farmaldehüüdi lahus vees).
  
• Kombineeritud fikseerimine
  
• Külmutuslõigud – koed külmutatakse ja lõigatakse peeneteks lõikudeks
  
• Parafiini sisestamine – tahkete kudede korral. Veetustamine, rasve eemaldamine, parafiini sisestamine, deparafiniseerimine.
  

VÄRVAINED!

• Hematoksüliin – aluseline värv, mis värvib rakkudes happelisi piirkondi (DNA, RNA)
  
• Eosiin – on fluorestseiini derivaat . Happeline värv, mis värvib rakus aluselisi piirkondi (tsütoplasma).
  
• Trüpaansinine – happeline värv, mis läbib surnud rakkude kahjustunud plasmamembraani ning värvib tsütoplasma valke.
  
• Propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid – pos laetud fluorestseeruvad ained, mis läbivad surnud rakkude kahjustunud plasmamembraani ja värvivad nukleiinhappeid (DNA, RNA). Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda.
  
• DAPI – DNA
  
• Hoechst – ka DAPI värvivad surnud ja elus rakke, Hoechst rohkem.