Rakubioloogia praktikum (0)

Eksam
1 nädal.
 1. Püsipreparaatide ettevalmistamise põhietapid (iga etapi eesmärk).
I. Fikseerimine
II. Etanooliga veetustamine
III.Ksüleeni immutamine
IV. Paraffiini sisestamine
Fikseerimine kindlustab kudedes toimuvate surmajärgsete muutuste ärahoidmise ja aitab kaasa tervikliku struktuuri säilitamisele.
Selleks, et koetükki hüdrofoobsesse paraffiini panna, tuleb seda enne hüdrofoobsesse lahustisse immutada ehk kõigepealt hüdrofiilsest veest lahti saada.
Seega, järgmiseks etapiks on koe etanooliga veetustamine ehk vee eemaldamine kude kasvavas etanooli gradiendis (50-100% etanooli) inkubeerides.
Järgmisena, etanool asendatakse hüdrofoobsema lahusti – ksüleeniga. Ksüleen on hüdrofoobne lahus, mis seguneb nii paraffiini kui ka etanooliga.
Ja alles pärast ksüleeniga immutamist kude võib sulanud paraffiini sisestada.
Pärast paraffiini tardumist kude lõigatakse õhukesteks lõikudeks, mis pannakse alusklaasile ja edasi värvitakse.
2. Elusrakkude värvimise põhietapid (iga etapi eesmärk).
Rakkude fikseerimine on rakupreparaadi kinnitamine alusklaasile nii, et edasise töötluse käigus rakud preparaadilt jalga ei laseks. Säilitab rakustruktuuri ja koosseisu ning peatab kõik raku sees toimuvad protsessid.
Perme (a?)biliseerimine – on rakumembraani muutmine läbilaskvamaks, et värvid ja antikehad pääseksid rakku sisse.
Värvimine – on raku värvi muutmine, et rakku oleks võimalik kergemini mikroskoobis tuvastada. Eri rakuosi on võimalik erinevalt värvida ja nii saame eristada rakuosi kergemini.

 a. Mis on erinevus formaldehüüd- ja alkohoolsete fiksaatorite vahel?
Tänu oma hüdrofiilsele –OH rühmale, alkoholid katkestavad vesiniksidemeid ja hävitavad valkude tertsiaarset struktuuri denatureerides ja sadestades neid.
Etanooli molekuli hüdrofoobne osa võib aga ka lipiididega seostuda, tõmmates neid raku membraanist välja ehk lahustades neid.
Seega lisaks fikseerimisele alkoholid tekitavad auke plasmamembraanis ehk permeabiliseerivad rakke.
 b. Kuidas detergendid toimivad ?
Detergendid – kergelt polaarsed molekulid, mis tõmbavad lipiidid plasmamembraanist välja. Alkoholi sarnaselt detergentidel on hüdrofoobne ja hüdrofiilne osa.
c. Histoloogiliste värvide klassid ; mis klassi hematoksüliin kuulub? Mis raku komponentidega see seostub?
I. Happelised (seostuvad katioonsete ehk aluseliste raku komponentidega) dye-
II. Aluselised (seostuvad anioonsete ehk happeliste raku komponentidega) dye+
Happelised värvivad aluselisi kompolnente (tsütoplasma); aluselised negatiivseid (DNA e tuum).
Hematoksüliin kuulub aluseliste värvide hulka, kuid tema struktuur nagu te näete erineb aluseliste värvide üldstruktuurist (nimelt happelisele komponendile seostub just alumiiniumi ioon , mitte molekuli orgaaniline osa). Nagu teooria räägib hematoksüliin seostub just anioonsetele komponentidele, sel põhjusel see ühend värvib tuuma ja negatiivselt laetud glükoproteiine plasmamembraanis.
   d. Miks pH on oluline hematoksüliini vävimisel?
Hematoksüliiniga värvimise käigus lahuse pH tõuseb üle 7.
Värvimise printsiip on selline – värvi molekul on funktsionaalne (võib seostuda negatiivsetele struktuuridele) ainult madala pH juures.
 e. Mis struktuuridega eosiin Y seostub?
Katioonsetele valkudele tsütoplasmas, ribosoomidele, mitokondritele.
3. Kuidas rakkude morfoloogia määrab nende funktsioone? Tooge näited.
Trofoblastid on endomeetriumisse sisse tungivad rakud, mille ülesandeks on varustada embrüot vajalike toitainetega .
Epiteelikihis rakud paiknevad üksteisele lähedal, minimaalse rakkudevahelise ruumiga.
Trofoblastid aga kipuvad kasvama minimaalse rakkudevahelise kontaktiga ja neile on iseloomulikud välja veninud kuju ja jätked
4. Kirjelda valgusmikroskoopia üldist tööpõhimõtet. Mis on tähtsamad valgusmikroskoobi komponendid?
objektiiv ja okulaar , valgusallikas ja kondenser, preparaadilaud, fokusseerimiskruvi ning statiiv , mis kõiki komponente koos hoiab.
5. Kuidas vererakke klassifitseeritakse? Nimeta leukotsüüte ja too välja nende olulisemad erinevused.
Vererakke on võimalik jaotada järgmiselt:

• erütrotsüüdid e. punased vererakud
  
• leukotsüüdid e. valged vererakud
  
• vereliistakud  e. trombotsüüdid. Need ei ole terviklikud rakud, vaid on tekkinud megakarüotsüütidest ja kujutavad endast nende rakkude kortikaalse tsütoplasma lahtitulnud fragmente.
  

Leukotsüüte ehk valgevereliblesid võib liigitada graanulite esinemise järgi granulaarseteks ja agranulaarseteks. basofiilid , neutrofiilid ja eosinofiilid ning agranulaarsed monotsüüdid ja lümfotsüüdid (B- ja T-rakud, loomulikud tapjarakud ). Agranulaarsed on monotsüüdid ja lümfotsüüdid.
2 nädal.
1.       Rakutsükkel (RT)
a.    Mis asi see on
Raku eluperiood ühest jagunemisest teiseni.
b.   RT faasid
M-faas (ProMeAnTel) ja Interfaas (G1, S, G2)
c.    DNA hulga muutus RT käigus
G1 -2n; S – 2n->4n, G2 -4n; M – 4n->2n
2.       DNA värvid
a.    Milliseid on
Etiidiumbromiid, DAPI jne. Positiivse laenguga.
b.   Fluorestsentsi intensiivsuse sõltuvus DNA hulgast
Mida rohkem on DNA-d, seda intensiivsem on fluoresents.
3.       RT tuvastamise võimalused
a.    Kõikide võimaluste eelised ja puudused
Fluoressents  - aeglane, ebatäpne. Aga näed ise oma silmaga
Läbivoolutsütomeetria – masin (peab vaid lootma , et ei valeta), kiire, konkreetne.
4.       Läbivoolutsütomeetria
a.    Kuidas tulemused näevad välja ehk graafikud
Graafikuid saab analüüsida ainult juhul, kui n-ö kontroll on olemas - pildil olevad populatsioonid on võrreldavad üksteisega, niisama ühest isoleeritud mõõtmisest midagi ei saa.
b.   Mis on tulpdiagramm /histogram
Tulpdiagramm - võrdleb mõõdetud nähtuste arvu vs mõõdetud näitajat (nt fluorestsents)
c.    Mis on punktdiagramm/dot plot
Dot plot (pildil) - iga event on punkt, võimaldab siduda 2 eri näitajat
5.       RT pilt läbivoolutsütomeetrias
a.    Normaalne
Enamus rake on ettevalmistavas faasis.
b.   Blokeeritud
Rakud kuhjuvad kuskile faasi
6.        Apoptoosi pilt läbivoolutsütomeetrias
DAPI x-teljel. 1 – Varane apoptoos, 2 – hilineapoptoos, 3- terved, 4- nekroos
3 nädal.
1. Mitoosi ja meioosi faasid; faaside eristamine valgusmikroskoobis
Valgusmikroskoobis on näha kromosoomide joondumist, lahtiliikumist , kondenseerumist, vaheseina teket. Mitoosi ja meioosi saab eristada selle järgi, kas raku tsentraaltasapinnal on reastunud kromosoomipaarid või kromosoomid ning kas lahknevad kromosoomid või kromosoom läheb kaheks. Mitoosi faasid: profaas metafaas anafaas telofaas . Meioos: Profaas I, Metafaas I, anafaas I, telofaas I, Profaas II, Metafaas II, Anafaas II, Telofaas II.
2. Kromsoomide tuvastamisemeetodid valgusmikroskoobis
Meetodeid on mitmeid, kuid kõige sagedamini kasutatakse G-vöödistust. G-vöödistus on peamine meetod, mida tsütogeneetilisel analüüsil kasutatakse. See võimaldab täpselt identifitseerida iga kromosoomi ja üles leida kromosoomide nähtavad struktuurimuutused. Mida pikemad on kromosoomid, seda rohkem vööte neile värvimisel peale tuleb.

• Q-vöödid/ Q- banding
  
• R-vöödid (R-banding – reverse banding)
  
• Ag-NOR-vöödid
  
• T-vöödid
  
• DAPI(Distamütsiin) A-vöödid
  

3. Polüteenkromosoomide ja lambihari-kromosoomide võrdlus
Lambiharikromosoomides toimub RNA süntees väga suurelt alalt, polüeteenkromosoomil on üksikud sellised alad.Lambiharikromosoomid meioosi esimeses profaasis , polüeteenrkomosoomid interfaasi nähtus.  
4. Inimese kromosoomide klassifikatsioon
Suured metatsentrilised, suured submetatsentrilised, keskmised submetatsentrilised, keskmised akrotsentrilised, väike metatsentriline , väikesed submetatsentrilised, väikesed akrotsentrilised, sugukromosoomid.
5. X-kromsoomi inaktivatsiooni protsess imetajal
Kromosoomi valik juhuslik. Ühes rakus võib inaktiveeruda üks, teises teine. Pakitakse väga tihedalt kokku.
Barri keha (miks ja milleks?)
Inaktiveerunud ja tugevalt kokku pakitud X kromosoom emastes organismides. Kuna kui on kaks X kromosoomi, siis oleks nende geenide produkti isastest poole rohkem ja asjad ei toimiks.
4 nädal.
1. Olulised töövõtted rakukultuuridega töötamisel. Kuidas tagatakse steriilsus rakkudega töötamisel? Vahetusjalanõud, kõik tööd steriilitud tõmbekapi all ja steriilitud vahenditega. Korke ei hoia kaua lahti, karpe ka mitte. Peseme käsi.
2. Millisel temperatuurid säilitatakse külmunud rakke? Kuidas minimeerida rakkude suremust külmutamisel?
-196
DMSO abil, mis takistab jääkristallide teket. Sulatada kiirelt.
3. Rakkude kasvukeskkond .  Keskkonnas peab olema kõik eluks vajalik. Peab olema sobiv. Substraat peab olema (tahke või vedel või pooltahke). Vahest vaja teist kultuuri, mille peal kasvada.
4. Rakuliinid ja rakutüübid, millega praktikumi jooksul tutvusid. HeLa – emakakaelavähi rakkudest, kandilised ja hajusalt; H1299 – kopsukartsinoomi rakud ( epiteel ) , kandilised, kobaratena; CaCo2 – käärsoolevähi rakud, ümarad ja kobarates; Val5 – hiire embrüonaalsed tüvirakud, pikad, hajusalt;
5. Kirjelda heas konditsioonis olevat rakukultuuri (kinnituvad rakud, jagunevad rakud, surnud rakud).
Oletades, et tegemist on substraadile kinnituva koega:
-rakud substraadile kinnitunud
- tihedad , aga mitte liiga tihedad
-jagunevad rakud natuke ümaramad ja neid leidub
-surnud rakke (need, mis ringi hulbivad) minimaalselt (võib ka rakke loendades protsentuaalselt vaadata; 'hea' elumuse protsent oleneb rakuliinist)
-pH indikaator normis
-kontaminatsiooni pole
6. Kirjelda tihedat rakukultuuri rakkude puhul, millel 1) toimib ja 2) ei toimi kontaktinhibitsioon. Toimib: kõrvuti, ei kasva edasi; Ei toimi: üksteise kukil kuhjades.
7. Rakukultuuri kontaminatsioon : füüsikaline, bioloogiline, keemiline.
füüsikaline-temperatuur, valgus, kiirgus, vibratsioon
keemiline-metalliioonid, endotoksiinid, org/ anorg ühendid, detergendid, seerumi koostis
bioloogiline-tavaliselt mõeldakse kontaminatsiooni al bioloogilist kontaminatsiooni; põhjustatud bakterite, mükoplasmade, viiruste, seente, pärmide, teiste eukarüootsete rakkude poolt
Kontaminatsioonile iseloomulik on:
-pH muutus
-hägusus
-ebameeldiv lõhn
8. Rakkude arvu määramine koekultuuri tassil (hematsütomeeter, rakkkude lugemine, rakkude arvu arvutamine).  Hematsütomeeter – loed rakud ühes teatud ühikus (1mm3) ja arvutad tassi koht. Loed igas ruudus , arvutad keskmise. Siis arvutad lahjenduste järgi tassi kohta.
9. Rakkude kasvukõver ja selle koostamine. Mida kasvukõver rakukultuuri kohta ütleb (nt fibroblastid vs epiteelirakud )?  Rakkude arv eri päevadel
10. Rakkude elulemus, elulemuse %-i arvutamine. Elumus: elus/ surnud. Elumuse % = elumus *100%
11. Töö rakkudega: kultuuride harvendamine (suspensioonis kasvav vs kinnituvad rakud)
Suspensioonis kasvavad rakud: suspensioon tsentrifuugitakse, sööde pealt, lisada uus sööde ja jagada
Substraadile kinnituvad rakud: saab jagada 2 viisil:
1)ensümaatiliselt (trüpsiin, kollagenaas või pronaas - rakud tulevad selle mõjul tassi küljest lahti) - sööde maha, +enz, oodata, +uus sööde, jagada
2)mehhaaniliselt - sööde maha, +natuke uut söödet, rakud tassilt 'maha pipeteerida'/scraperiga maha kraapida, jagada