Hiirtel tekivad nt varbad apoptoosi käigus, apoptoosi teel tekivad varbavahed. Staadiumid: antakse signaal see jõuab mitokondrini tsütokroomC tuleb periplasmast välja, sest kaotab heemi (ilma tsütokroomC-ta jäävad elektronid seisma, tekivad radikaalid) läbib rida kaspaase (mis on apoptoosi algatajateks ja läbiviijateks) DNA fragmenteerumine, tekivad väikesed membraaniga ümbritsetud vesiikulid. Et rakke värvida, peab nende membraan olema kahjustatud, siis PI, DAPI pääsevad sisse. Rakud mis värvuvad on järelikult kahjustunud või surnud (surnud või hilises apoptoosis). DNA värvid: DAPI, PI, 7AAD. Fluorestsents aine omadus neelata kõrgema lainepikkusega footoneid. Kiire protsess (nanosekundite küsimus). FAS antikeha annab rakule intensiivsust, väärtuse läbivoolutsütomeetria. + suhtelised suurused ja granulaarsus. Suurem intensiivsus rohkem paremat saaki. G1 1kordne genoom. S DNA süntees.
Agranulaarsed on monotsüüdid ja lümfotsüüdid. 2 nädal. 1. Rakutsükkel (RT) a. Mis asi see on Raku eluperiood ühest jagunemisest teiseni. b. RT faasid M-faas (ProMeAnTel) ja Interfaas (G1, S, G2) c. DNA hulga muutus RT käigus G1 -2n; S 2n->4n, G2 -4n; M 4n->2n 2. DNA värvid a. Milliseid on Etiidiumbromiid, DAPI jne. Positiivse laenguga. b. Fluorestsentsi intensiivsuse sõltuvus DNA hulgast Mida rohkem on DNA-d, seda intensiivsem on fluoresents. 3. RT tuvastamise võimalused a. Kõikide võimaluste eelised ja puudused Fluoressents - aeglane, ebatäpne. Aga näed ise oma silmaga Läbivoolutsütomeetria masin (peab vaid lootma, et ei valeta), kiire, konkreetne. 4. Läbivoolutsütomeetria
Meetod hõlmab endas denatureerimist leelisega, järgnevat inkubeerimist 65ºC juures ja värvimist Giemsa lahusega. C-vöödistusega värvuvad valikulkiselt struktuurse heterokromatiini alad nii metafaasis kui ka interfaasi tuumas. C-vöödid on päranduvad kromosoomielemendid. Restriktsiooni endonukleaas/ Giemsa meetod sisaldab endas kromosoomide fikseerimist metafaasis metanool/jää-äädikhappega ja töötlust Dnaasidega. Töötluse tagajärjel tekib C-vöödi sarnane muster. DA/DAPI fluorestsentsanalüüs. Kui inimese kromosoome värvida ainult DAPI-ga (4´-6-diamidino-2- fenüülindool), siis näeb lisaks Q-vöödistusele sarnase mustri ka suuri briljantselt hiilgava heterokromatiini blokke, kuid seda vaid 1. ja 16. kromosoomi puhul. Kui kromosoome värvida disramütsiin A-ga ja seejärel DAPI-ga, siis on briljantselt hiilgavad alad näha paljudes kromosoomides. Nukleosiid-vastaste antikehadega töötlus. Meetod seisneb DNA denatureerimises UV-ga,
emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. 142. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. 143. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, asmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist. 144. 145. Esimene päev – rakkude fikseerimine 1
3. Kuidas töötab fluorestsentsmikroskoop? Ergastav valgus juhitakse läbi filtri uuritava objektini. Filter laseb läbi ainult kindla lainepikkusega valgust, mis on sobiv fluorokroomi ergastamiseks. Emiteeritud valgus sorteeritakse palju tugevamast ergastavast valgusest teise filtri abil. 4. Nimeta erinevaid võimalusi rakukomponentide märgistamiseks fluorokroomidega? Fluorestseeruvad värvid: Difundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. Näiteks DNA värvid propiidiumjodiid, Hoest, DAPI jt. Immuunofluorestsents: Kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy, jne.) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. Fluorestseeruvad valgud: Selleks ekspresseeritakse rakkudes uuritava valgu ja fluorestseeruva valgu liitvalku
anneksiin viie (anneksiin-V) abil. Fluorestsentsmärgisega anneksiin-V seondub kaltsiumi juuresolekul fosfatidüülseriiniga, märgistades sel viisil apoptootilisi rakke. Kuna fosfatidüülseriin muudab oma orientatsiooni juba apoptoosi algetapis, võimaldab anneksiin-V-ga märgistamine tuvastada just varajases apoptoosis olevaid rakke. Hilises apoptoosis olevaid rakke saab tuvastada membraani läbilaskvuse meetodiga. Selleks kasutatakse DNAga seonduvaid fluorestsentsvärve (DAPI). Fluorokroomid ei pääse tervest rakumembraanist sisse, kui apoptoos on toimunud piisavalt kaua, muutub membraan auklikuks ja värv pääseb sisse ja seostub DNAga. TUNEL assay – TdT- meditated dUTP Nick-End Labeling – apoptootilisi tuumi saab tuvastada
Primaarse antikehaga inkubeerimisel seondub primaarne antikeha antigeeniga antud juhul tubuliiniga. Inkubeerides sekundaarse antikehaga seonduvad sekundaarsed antikehad primaarse antikehaga. Kahekihiline reaktsioon on vajalik selleks, et poleks vaja iga primaarset antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Alusklaasidele panemine on vajalik mikroskopeerimiseks. Sulundamislahus sisaldab DAPI-t, mis seondub DNA-ga ning fluorestseerub siniselt, see võimaldab fluorestsentsmikroskoobiga näha ka DNA-d. 14. a. Kontroll-plasmiidiga rakud: Pildil on näha siniselt DNA, roheliselt edukalt transfekteeritud rakkudes ekspresseeritud GFP ning punaselt antikehaga värvitud tubuliin. pEGFP FoxO3a-ga transfekteeritud rakud: b. Valke detekteerisin kahekihilise reaktsioonina. Primaarseks antikehaks oli Mouse anti tubuliin 1:500 ja sekundaarseks antikehaks Goat anti mouse Alexa546 1:2000
Ergastamiseks vajaliku kiirguse lainepikkus on alati lühem, kui emiteeritav kiirgus. Sinise valgusega ergastades saame rohelise fluorestsentsi ja rohelise valgusega ergastades saame punase fluorestsensi. Iga fluorokroomi iseloomustavad neeldumis- ja emissioonispektrid. Enamus molekule rakus ei fluorestseeru ja seetõttu kasutatakse fluorestseeruvaid märgiseid. • Fluorestseeruvad värvid – diffundeeruvad rakku ja seostuvad märklauaga. N. DNA värvid propiidiumjodiid, Hoechst, DAPI jt • Immuunofluorestsents – kasutatakse fluorestseeruva märgisega (FITC, Alexa, Cy jt) konjugeeritud antikehasid. Enamasti tehakse kahekihiline reaktsioon, esmalt kasutatakse uuritava valgu vastaseid primaarseid antikehasid ja seejärel fluorokroomiga konjugeeritud sekundaarseid antikehi, mis seostuvad primaarse antikeha konstantsete regioonidega. See võimaldab signaali amplifitseerimist, sest ühe primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha.
jäänuseid); röövvormid, kes söövad eelkõige oma lähedasi sugulasi teisi zooplanktereid. Zooplanktoni hulka mõjutavad keskkonnategurid - vee temperatuur, toit, vetikamürgid, kalad. Zooplanktoni osa veekogu toiduahelas asub ahelas min teisel kohal. Fütoplankton detriit + bakterid- zooplankton- kala. Kuidas määratakse bakterite üldarv ja saprobakterite arv - Üldarv (BÜA)- rakkude (miljonit) arv 1 ml-s. Rakud värvitakse nukleiinhappe värviga (DAPI, SYBR, jne), filtreeritakse 0,2 µm poori läbimõõduga filtrile, loendatakse epifluorestsentsmikroskoobiga Saprobakterid (SAPRO) - kergesti lagundatavat orgaanilist ainet kasutavad bakterid, kes on võimelised kasvama söötmetel Bakterite jaotus temperatuurieelistuse järgi - miinimum optimum maksimum psührofiilid -10º....0º 5º....20º 30º....35º
·Uniparentaalse disoomia puhul pärib indiviid spetsiifilise kromosoomi mõlemad homoloogid samalt vanemalt 5.Klassikalised kromosoomide värvimistehnikad G-bändid: kromosoome töödeldakse trüpsiiniga ja värvitakse Giemsa värviga. Tumedalt värvuvad vöödid on tuntud G-bändidena. R-bändid: p6himõtteliselt vastupidine G bändingule. Kromosoomid denatureeritakse kuuma ja sooladega enne Giemsa värvimist. Q-bänding: kromosoome värvitakse fluorestseeruvate värvidega (DAPI, Hoechst 33528), mis seostuvad eelistatult AT rikastele regioonidele. Kromosoome vaadeldakse UV-valguses. Samane G-bändidega. C-bändid: arvatavasti esindavad konstitutiivset heterokromatiini. Kromosoome denatureeritakse BaOH lahusega, millele järgneb Giemsa värvivimine. 6.FISH ja tema variatsioonid - · : 1. (). 2. in situ (FISH). 3. FISH : + FISH; + FISH; + FISH (FICTION); · : 1. (Whole painting)
annaabi.ee 
