uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi (taandavad) summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Lühidalt, oma sõnadega kirjutada, millel baseerub antud katses kompleksomeetriline meetod. Põhireaktiiviks on aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi, mis toimib invertaasile inaktiveerivalt (see lõpetab ensüümireaktsiooni) ning tagab ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku aluselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Hiljem (keetmisel) taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks (suhkrute toimel), Cu 2O eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille koguse saab määrata tiitrimise teel vasksulfaadi lahusega, kui vabanenud triloon B komplekseerub uuesti vasega (on märgatav mureksiidi värvuse muutuse tõttu). Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Selles töös kasutan komleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. See valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola. See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kaht rolli: tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni; tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse
Invertaasi aktiivsust määratakse sahharoosi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Saadud produktide koguse kindlaks määramiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks tugevalt aluseline lahus, kus on vask(II)-triloon B kompleks. Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile muudab ta invertaasi, mille pH opt=4,8, inaktiivseks ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samas tagab ta ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldav proov viiakse komplekslahusesse ning keedetakse, mille käigus taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena sadenev Cu2O ning lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B:
reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust
reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO 4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust
kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid. Antud töös kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi (valmistatakse kõrge konsentratsiooniga lahuses, võttes üks ühele hulga ja triloon-B). Antud reaktiiv täidab kahte rolli: · Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile mille pH 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. · Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Taandavaid suhkruid sisaldav reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine
Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. · Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisasin sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne lahjendus. · Katseklaasi sulgesin korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine. · Võtsin 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%- line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. · Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin umbes 5 10 minutiks vesitermostaati juurde soojenema. · Võtsin 3 koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Komplekslahus oli erksinine.
reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitrimisel komplekseerub triloon B Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist saab
produktid on D-fruktoos ja D-glükoos. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel: , D-glükoos , D- fruktoos Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutasin kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiivis on selles meetodis tugevalt aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Sellel reaktiivil on käesoleva meetodi läbiviimisel kaks ülesannet: 1) ta lõpetab ensüümireaktsiooni, kuna toimub tugevalt aluseline reaktsioon, mis mõjub invertaasile inaktiveerivalt 2) ta tagab leeliselise keskkonna ja vask(II) triloon B kompleksi, mis on vajalik taandavate suhkrute määramiseks. Reaktsioonisegu, mis sisaldab taandavaid suhkruid peab kuumutama, sest siis taandub Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)- eks ning moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B-d, tänu millele saabki suhkrute kontsentratsiooni määrata.
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Töös leiab kasutamist kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon-B kompleksi. Reaktiiv lõpetab ensüümireaktsiooni ja tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena eralduv Cu2O. Reaktsioonil vabaneb vaba triloon-B, mille kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus tahke ensüümi puhul avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta. 1 mikrokatal on
kohta (kat/ml). 2. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine (vedelast ensüümipreparaadist) Lahustina kasutatakse atsetaatpuhvrit, mille pH = 4,8. Juhendaja etteantud andmetel tuli töölahust valmistada 5 ml, ehk teha vedelast invertiinist 50-kordne lahjendus. Automaatpipeti abil võtsin 100l invertiini ning lisasin 5-ml kriipsuni atsetaatpuhvrit. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin, et kontsentratsioon ühtlustuks Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris), katseklaas suletakse korgiga ja jäetakse vesitermostaati ~30 juurde soojenema. · Võetakse kolm 250 ml mahuga koonilist kolbi, kuhu pipeteeritakse 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust erinevatel aegadel proove, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldus.
Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust.
termostaati 10 minutiks C juures. 3. Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteerin igasse 10 ml komplekslahust. 4. Kui substraat saavutas temperatuuri , lisan sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust, loksutan ja asetan termostaati. Reaktsiooniks kulgenud aeg fikseerin stopperiga. 5. Kohe peale reaktsiooni segu läbiloksutamist pipeteerin 1 ml reaktsioonisegu lahust komplekslahusega kolbi (proov 1). 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust pipeteerin 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi (proov 2). 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust pipeteerin 1 ml reaktsioonisegu kolmandasse kolbi (proov 3). 6. Koonilised kolvid asetan pliidile püstjahutite alla ja keedan neid 10 minutit. Kolvidesse tekib punane vask (1) oksiidi sade. 7. 10 minuti pärast lõpetan keetmist, lisades igasse kolbi 150 ml destilleeritud vett. Jahutan kolvid kraanivee all toatemperatuurini. 8
Ensüümreaktsiooni läbiviimine Võtan 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteerin 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaaspuhvris (pH = 4,8). Katseklaas varustan korgiga ja asetan 10 minutiks vesitermostaati 30±1°C juurde soojenema. Võtan kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerin 10 ml komplekslahust. Nummerdan neid. Kui substraat on soojenenud, lisan sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust. Lahust loksutan läbi ja fikseerin ensüümireaktsiooni alguse aeg. Võtan kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viin esimesse kolbi, kus on komplekslahus (0-proov). Kohe asetan katseklaas termostaati tagasi. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtan sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viin teise kolbi. 20 minutit peale ensüümreaktsiooni algust võtan veel 1 ml reaktsioonisegu ja viin kolmandasse kolbi. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Kolvid asetan elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema
Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Valmistada proteaasi preparaadist sobiva pH väärtusega puhvris lahus, ensüümi (antud juhul alkalaas) kontsentratsioon peaks olema lahuses 1-5 mg/ml, antud katses oli ensüümi kontsentratsiooniks 1,56 mg/ml (kaalutis 7,8mg). Kui ensüümpreparaadile on väike kogus puhverlahust lisatud, segada lahust klaaspulgaga u 5 min, kuni ensüüm lahustub. Seejärel täita klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutada kõik läbi. Ensüümireaktsiooni läbiviimine Võtta 50 ml katseklaas ning pipeteerida sinna 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Sulgeda klaas korgiga ning jätta 30 kraadi juurde soojenema 5-10 minutiks. Võtta ja nummerdada 4 kuiva tavalist katseklaasi ning pipeteerida neisse 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustada ensüümireaktsiooni: selleks pipeteerida kaseiini sisaldavasse katseklaasi 1 ml proteaasi töölahust, loksutada, fikseerida aeg. Peale ensüümi
gradueeritud katseklaasi. Kaalutis = 0,0074 g · Lisasin väikese koguse puhverlahust ja segasin klaaspulgaga umbes 5 min kuni ensüüm on lahustunud. Ensüümipreparaat lahustus peaaegu täielikult, sest see sisaldas ka täiteainet, mis ei lahustunud. Seepärast tekkinud lahus ei olnud täielikult selge. · Seejärel täitsin klaasi puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutasin läbi, et ensüümi kontsentratsiooni lahuses ühtlustada. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 ml mahuga suur katsekaas, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. · Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati juurde umbes 5 10 minutiks soojenema. · Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin. · Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
kontsentratsiooniga Na2CO3-st, CuSO4-st ja triloon B-st (etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi sool). Kuna reaktiiv on tugevalt aluseline, lõpetab ta invertaasi ensüümireaktsiooni. Peale invertaasi reaktsiooni on reaktsioonisegus taandavad suhkrud. Segu viiakse
metalloproteinaasideks. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270- 280nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini
osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin uuritavast proteaasi preparaadist, milleks oli savinaas, ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse, milles ensüümi kontsentratsioon oleks vahemikus 1-5 mg/mL. Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel 0,0080 g ehk 8 mg savinaasi, panin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin puhverlaust. Segasin lahust senikaua, kuni ensüüm oli täielikult lahustunud. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine Võtsin 50 mL mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli eelnevalt reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Sulgesin katseklaasi korgiga ja panin vesitermostaati 30 C juurde u 10 minutiks soojenema. Võtsin 4 kuiva katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipeteerisin igasse katseklaasi 3 mL 5%-list TKÄ lahust. Pärast kaseiinilahuse soojenemist, alustasin ensüümireaktsiooni. Selleks pipeteerisin
Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse Kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Vask(II)-triloon B kompleks täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli: · tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. · tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Hüdrolüüsisegust võetud, taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega,
(pH = 4,8). Ensüümi kontsentratsioon lahuses tahkel preparaadil on 5mg/ml kohta. 2. Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme 3. koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 4. 5-10 min. pärast võetakse sahharoosi lahus termostaadist ning lisatakse 1 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja asetatakse katseklaas termostaati tagasi ning käivitatakse stopper või fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. 5. Kohe peale ensüümi lisamist võetakse kuiva pipetiga 1 ml hüdrolüüsisegu ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. Selles määratav taandaavate suhkrute sisaldus iseloomustab 0- proovi. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeritakse 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ja 20 min. pärast kolmandasse kolbi. 6. Kolvid reaktsiooniseguga asetatakse 10 minutiks elektripliidile püstjahuti alla keema.
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Alkalaasi preparaadist valmistasin ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse. Arvutasin, et 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 10 mg alkalaasi preparaati. Analüütilisel kaalul sain kaalutiseks 10,7 mg. Viisin ensüümipreparaadi kadudeta katseklaasi. Lisasin 5 ml boraatpuhvrit, mille pH oli 8,4. Segasin lahust klaaspulgaga, et ensüüm lahustuks. Kuna preparaadid sisaldavad ka täiteainet, siis selget lahust ei tekkinud. Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi läbiviimine 50 ml mahuga katseklaasi pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi ja nummerdasin nad. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust
Viimaste suhkrute kontsentratsiooni määramine tehakse kindlaks kompleksomeetrilisel meetodil, kus põhireaktiiv, mis on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)- triloon B kompleksi. Kompleks valmistatakse Na 2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA-Na –d (etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi sool). Kuna see lahus on tugevalt aluseline ning invertaasi optimaalne pH on 4,8, siis mõjub see lahus inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. Samuti on taandavate suhkrute määramiseks vajalik leeliseline keskkond ja vask(II)-triloon B kompleks. Reaktsioonisegust kindlal ajahetkel võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub kompleksis sisalduv vask(II) suhkrute toimel vask(I)-ks. Seejärel moodustub Cu 2O, seda on näha punase sademena, mis tekib sinise lahuse põhja. Ekvivalentses koguses jääb lahusesse vaba triloon B.
kaaludel 5 mg (0,005 g) Alcalase. Selleks,et valmistada töölahust tuleb: · loputada kaaluklaasi 8,2 pH väärtusega puhverlahusega · kaaluda analüütilise kaaludel kaaluklaasi ilma ensüümideta · kaaluda vajalik ensüümi kogus · lisada väike kogus puhverlahust,loksutada hoolikalt · valada kaaluklaasist lahus lahuse valmistamiseks sobiva anumasse (10 ml katseklaas) · lisada kuni 5 ml kriipsuni puhverlahust ja loksutada. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine 1) Võtan 50 ml mahuga suur katseklaas,kuhu pipeteerin 25 ml 2%-list kaseiini lahust.Klaasi peale panen parafilmi ja asetan vesitermostaati °C juurde umbes 5-10 minutiks soojenema. 2) Võtan 4 kuiva katseklaasi (20 ml) ja nummerdan.Igaühte pipeteerin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. 3) Kui kaseiini lahus on 30 °C-ni soojenenud,alustan ensüümireaktsiooni-kaseiini hüdrolüüsi
Ensüümid elusrakkudes kulgevate biokeemiliste reaktsioonide kiirendajad e katalüsaatorid, mis suunavad ja reguleerivad tuhandeid degradatsiooni, sünteesi, energia ülekande jpt reaktsioone; ensüümide ehitus kõik ensüümid, va mõni katalüütiline RNA, on valgud, koosneb aminohapetest, temas on nii aktiivtsener kui regulatoorsed tsentrid; Aktiivtsenter ensüümi molekuli piirkond, mis otseselt osaleb katalüütilises protsessid, aktiivtsentri mõjtamine avaldab mõju ka ensüümireaktsiooni kiirusele (nn ensüümi aktiivsusele); Ensüümireaktsiooni põhiskeem - E + S ES P + E ensüüm substraat ensüüm- produkt ensüüm substraat kompleks Akriivtsenter ja substraat peavad olema komplementaarsed, et saaks tekkida ES kompleks. 2
kiirus on võrdne aine algkontsentratsooniga, ehk -dC/dt = k1C0 1= k1C. II järku reaktsioonide võrrandid ja kiiruskonstandid - selline reaktsiooni järk, milles reaktsiooni kiirus on võrdeline substraadi algkontsentratsiooni ruuduga - -dC/dt = k2C0 2= k2 C2 . Kõigis neis järkudereaktsioonides on C0 substraadi algkontsentratsioon ja k-d vastavate reaktsioonide kiiruskonstandid . 2. Monosubstraatse ensüümireaktsiooni täielik ja lihtsustatud võrrand, kiiruskonstantide tähendus ja dimensioonid. Monosubstraatne reaktsiooni nimetus vihjab ilmselt sellele, et tegemist on ühe ensüümi reageerimise teise ainega. Sellise ensüümireaktsiooni järk sõltub aine kontsentratsioonist, ehk kui tegu on madala kontsentratsiooniga, on reaktsioon 1 järku, kui kõrge konts. siis 0 järku (e. reaktsiooni kiirus ei sõltu aine algkontsentatsioonist)
reaktsioonisegust võetud proovides. 2. Töö käik 1.3 Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Minu uuritav preparaat oli alkanaas. Valmistasin uuritavast preparaadist ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml.Valmistasin 5 ml töölahust. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel 7,5 mg ehk 0, 0075 g alkanaasi ja lahustasin selle klaaspulga abil boraatpuhvris, mille pH=8,4. 1.4 Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine 1) Võtsin 50 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 ºC juurde 10 minutiks 2) Võtsin 4 kuiva katseklaasi normaalmõõdus ja nummereerisin need. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. 3) Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi alustasin, kui kaseiini lahus oli 30 ºC-ni soojenenud
kaalutise suurus (0,02 g). Analüütilistel kaaludel kaalutakse sobiva suurusega kaaluklaasi vajalik kogus ensüümipreparaati ja viiakse kadudeta gradueeritud katseklaasi. Lisatakse väike kogus puhverlahust ja segatakse klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud. Seejärel täidetakse klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni (20 ml) ja loksutatakse läbi, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · Võetakse 50 ml mahuga suur katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiin lahust. Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 °C juurde umbes 7 minutiks soojenema. · Võetakse 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdatakse. Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5%-list TKÄ lahust. · Kui kaseiini lahus on 30 °C-ni soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni kaseiini hüdrolüüsi
Praktikumi juhendaja näpunäidete järgi valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümi kontsentratsiooniga lahust (nn töölahust). Lahustina kasutasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Vedelat invertaasi lahust lahjendasin puhvriga 50 korda, ehk pipeteerisin automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi 0,2 ml invertaasi lahust ja seejärel täitsin katseklaasi kuni 10 ml-ni puhverlahusega. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Kõigepealt võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH-väärtusega 4,8. Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1oC juurde soojenema. Seejärel võtsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viisin
Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus kasutades kalibreerimissirget mis on eelnevalt valmist tehtud. Ensüümi aktiivsuse ühik on mikrokatal (µkat). Üks mikrokatal võrdub 1 sekundi jooksul tehtud 1 mikromool produkti 30 kraadi celsiuse järgi. TÖÖ KÄIGUD Töö käigud koosnevad kolmest osast: ensüümipreparaadi valmistamine, ensüümireaktsiooni läbiviimine ja tiitrimine ehk taandatud suhkru kontsentratsiooni määramine. Vajalikud töövahendid, ained ja nende kogused on töökäigus ära märgitud. 1. Ensüümpreparaadi valmistamine Vajalikud töövahendid - Automaat pipett (kuni 1ml-ne) - väike keeduklaas tahke invertaasi koguse kaalumiseks - gradueeritud katseklaas kuhu läheb invertaasi ja atetaatpuhvi lahus - analüütiline kaal (0.0001 grammi täpsusega)
3 20 19,8 17,5 C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, = 2 C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml, =10,3 V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml, = 26 ml 10^3 tegur üleminekuks mikrogrammidele, T hüdrolüüsi kestus, s, 180 glükoosi molekulmass, V3 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, 1 ml, V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, 1 ml, A1= ((10.3-2) x 26 x 1000 x 50) / ( 13 x 60 x 180 x 1 x 1) =76,9 mikrokatalit/ ml A2=((17,5-2) x 26 x 1000 x 50) / ( 24 x 60 x 180 x 1 x 1) =77,7 mikrokatalit/ ml Esimene hüdrolüüsi kestvuse viga oli umbes 3 minutit, teisel juhul umbes 1 minut. Ebatäpsused tulenesid mõõtmisvigadest ja 0-proovi aeglaselt võtmisest, mille tulemusena nihkusid ka teiste proovide ajad.
pH=4,8. Seda segati klaaspulgaga 5 minutit. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 7%-list sahharoosilahust atsetaatpuhvris (pH=4,8) ja katseklaas asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10ks minutiks. Samal ajal valmistati ette kolm 250ml koonilist kolbi, pipeteerides sinna 10ml komplekslahust. Kui substraat termostaadis 10 minutit oli olnud, võeti see välja, lisati sellele 1ml invertaasi töölahust, loksutati katseklaasi, fikseeriti ensüümireaktsiooni algusaeg, võeti sealt kuiva pipetiga 1ml lahust ja asetati katseklaasi tagasi termostaati. Pipett tühjendati esimesse komplekslahusega kolbi. See oli 0-proov. 10 minuti pärast võeti sama pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja viidi teise kolbi, katseklaas asetati tagasi termostaati, kust see järgmise 10 minuti pärast taas võeti, et ka kolmandasse kolbi 1ml reaktsioonisegu viia. Esimesed kaks kolbi pandi elektripliidile püstjahutite alla. Kui need keema hakkasid, fikseeriti
(reguleeritud atsetaatpuhvri abil). Lahus asetatakse vesitermostaati 30ºC juurde soojenema (5- 10 min). Tehakse ka uuritav invertaasi lahus. selleks kaalutakse 0,0208 g tahket invertaasi ja lahustatakse seda atsetaatpuhvris 5 ml-ni (pH = 4,8). 2. Kolme koonilisse kolbi mahuga 250-300 ml pipeteeritakse 10 ml komplekslahust. 3. 5-10 min. pärast sahharoosi lahusele lisatakse 0,5 ml uuritavat invertaasilahust., loksutatakse ja käivitatakse stokker või fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. 4. Kohe peale ensüümi lisamist võetakse 1 ml hüdrolüüsisegu ja viiakse ühte koöbidest, kus on komplekslahus. Selles määratav taandaavate suhkrute sisaldus iseloomustab 0-proovi. 10 min- peale ensüümi lisamist pipeteeritakse 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ja siis 20 min. pärast kolmandasse kolbi. 5. Kolvid reaktsiooniseguga asetatakse 10 minutiks elektripliidile püstjahuti alla keema.
lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahus asetati termostaati 30oC juures soojenema kümneks minutiks. Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 30oC termostateeritud sahharoosi lahusele lisati 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi invertiini lahust. Loksutati ja fikseeriti ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. Kuiva pipetiga võeti kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viidi ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See oli 0-proov, mis iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeriti 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning omakorda 10 min pärast 1 ml kolmandasse. Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetati 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema
Lahuse asetasin termostaati 30°C juures soojenema kümneks minutiks. Valmistasin uuritava invertaasi lahuse: kasutasin vedelat invertaasi . Võtsin seda 0,3 ml, invertaasi lahust kokku oli 9 ml. Valmistasin ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteerisin kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml 10 ml komplekslahust. Substraadi lahusele lisasin 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi lahust. Loksutasin ja fikseerisin ensüümireaktsiooni alguse. Kuiva pipetiga võtsin kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viisin ühte kolbidest, kus oli komplekslahus. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteerisin 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning 20 min pärast 1 ml kolmandasse. Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetasin 10 min elektripliidile püstjahuti alla keema. Keemistemperatuuril toimus vase redutseerumine taandavate suhkrute toimel. Keetmise lõpetamiseks
20 minuti proov 14,9 13,2 Invertaasi aktiivsuse leidmiseks kasutati valemit C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele T hüdrolüüsi kestus, s 180 glükoosi molekulmass V3 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml g ensüümipreparaadi kaalutis, g Invertaasi aktiivsus 10.minuti proovis 3 See tähendab, et 1 g invertiini aktiivsus on 186,7 µkatalit 1 g invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 186,7 mol taandavat suhkrut sekundis. Invertaasi aktiivsus 20. minuti proovis See tähendab, et 1 g invertiini aktiivsus on 282,5 µkatalit 1 g invertiinipreparaadi toimel
A = (C2 C1) · V1 · V2 · 103 / (T · 180 · V3 · V4 · g) , kus: C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml, V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml, V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele, T hüdrolüüsi kestus, s, 180 glükoosi molekulmass, V3 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml, V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml, G ensüümipreparaadi kaalutis, g. Invertaasi aktiivsus 10 minuti proovis: A10 = (7,8 1,3) · 10,4 · 5 · 103 / (600 · 180 · 1 · 0,4 · 0,0151) = 518,2 kat/g See tähendab ,et 1g invertiini aktiivsus on 518,2 katalit 1g invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 518,2 mol taandavat suhkrut sekundis. Invertaasi aktiivsus 20 minuti proovis: A20 = (11,1 1,3) · 10,4 · 5 · 103 / (1200 · 180 · 1 · 0,4 · 0,0151) = 390,7 kat/g
Katalüüsitavad reaktsioonid jõuavad tasakaaluolekusse palju kiiremini kui mittekatalüüsitavad, kuid reaktsioonide üldine tasakaal seejuures ei muutu. Kiiruse drastiline suurenemine toimub tänu oluliselt madalamale aktivatsiooni vabaenergia (= aktivatsioonienergia) tasemele siirdeseisundis. Joonisel on esitatud vabaenergia profiilid hüpoteetilisele ensümaatilisele ja mitteensümaatilisele reaktsioonile. Paneme tähele suurt erinevust ensüümireaktsiooni (sinine) ja mittekatalüütilise reaktsiooni (punane) aktivatsioonienergia G väärtustes, samas on mõlema reaktsiooni üldine vabaenergia muut G võrdne. Siirdeseisund G; aktivatsiooni G; ensüümireaktsiooni vabaenergia aktivatsiooni vabaenergia mittekatalüütilisel Vabaenergia, G
A = (C2 C1) · V1 · 103 · L / T · 180 · V3 · V4 kus: C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml, V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml, V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele, T hüdrolüüsi kestus, s, 180 glükoosi molekulmass, V3 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml, V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml, L - lahjendusmäär Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena, kus ühes on ajaks 10 min = 600 s ja teises 20 min =1200 s. Kui töö on läbi viidud korrektselt, peaksid tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20% võrra. Kui aktiivsuste erinevus on oluliselt suurem, siis tuleb kindlasti analüüsida, kus võis töös viga tekkida. Tulemused
· Järgnevalt segasin gradueeritud katseklaasi segu 5 minuti vältel, et ensüüm lahustuks. Selgelt lahust seejuures ei tekkinud, sest uurisin tehnilist ensüümipreparaati, mis lisaks ensüümivalkudele sisaldab ka muid valke ja täiteaineid. · Hiljem viisin katseklaasis oleva lahuse sobiva mahuni, milleks oli 5 mL ja lisasin katseklaasile korgi ja loksutasin seda, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 mL lahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin pipetiga 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Asetasin katseklaasile korgi ja asetasin eelnevalt soojendama pandud vesitermostaati 30°C juurde 10ks minutiks soojenema. · Järgnevalt nummerdasin 4 kuiva katseklaasi ja pipeteerisin igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust.
Puhvri valmistamine: Kaalusin 0,12 g boorhapet lisades dest vett kuni 10 ml. Kaalusin 0,19 g booraksit lisades vett kuni 10 ml. Väikese keeduklaasi pipeteerisin 5,5 ml boorhappe lahust ja 4,5 ml booraksi lahust. Kontrollisin lahuse pH ja sain 8,6, mis vastab nõutele. Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine: Töölahuse kontsentratsioon peaks olema 2 mg/ml ja töölahuse kogus 5 ml. Sellest ma sain teada, et tahket ainet on 10 mg. Siis segasin 10 mg savinaasi 5 ml veega. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine: Pipeteerisiin tuubi 12 ml 2% - list kaseiini lahust ja panin termostaati 30oC juurde. Nummerdasin 4 kuiva 15 ml tuubi ja pipeteerisin sinna 1 ml 5% - list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 0,5 ml valmistatud proteaasi töölahust, reaktsioonisegu loksutasin kiiresti läbi ja võtsin nullproovi. Peale ensüümi lisamist võtsin puhta pipetiga võimalikult kiiresti 2 ml reaktsioonisegu, viisin
Kasutame antud valemi: A=(C2-C1)* V1* V2 *103/T * 180 *V3 *V4*g Kus: C1-taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis. C2-taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis (mg/ml) V1-reaktsioonisegu üldmaht (ml) V2-ensüümi töölahuse üldmaht (ml) T -hüdrolüüsi ketus (s) 180-glükoosi molekullmass V3 -proovi maht taandavate suhkrute määramiseks (ml) V4-ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahusemaht (ml) g -ensüümiprepraati kaalutis (g) Töö tulemused! :D Proovi number Kuulunud CuSO4 Glyc mg/ml ml 0 (0 minutil võtnud) 2,3 2 1 (10 minutil) 12,6 11,1 2 (20 minutil) 23,3 18 Leiame invertaasi aktiivsuse(A): A=(C2-C1)* V1* V2 *103/T * 180 *V3 *V4*g
loksutan reaktsioonisegu läbi ja fikseerin reaktsiooni alguse aeg. Võimalikult kiiresti võtan puhta kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov) ja loksutan hoolega. Peale proovi võtmist asetan reaktsiooniseguga katseklaas tagasi termostaati. Täpselt 5 minuti pärast võtan saa pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja klaasi sisu loksutan hoolega läbi. Sama operatsiooni kordan veel 2 korda, s.t. ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Proovidega katseklaasit jätan 15 minutiks sademe formeerumiseks. Sel ajal panen valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustan neid väikeste plastlehtrite ning paberfiltritega. 15 minuti pärast filtrin kuivadesse katseklaasidesse. Saadud filtraadid on täiesti selged. Spektrofotomeetril määran nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise
sisaldab ka täietainet, mis ei lahustu, siis selget lahust ei teki). Viin mahu 5 ml-ni ja loksutan lahuse läbi, et kontsentratsioon ühtlustuks. Võtan 50 ml-se katseklaasi ja pipeteerin sinna 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Panen katseklaasile korgi peale ning asetan termostaati 30oC umbes 5-10 minutiks. Kuni substraat soojeneb, võtan 4 kuiva 20 ml katseklaasi ja nummerdan. Pipeteerin igaühte neist 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Pärast kaseiini soojenemist alustan ensüümireaktsiooni. Pipeteerin kaseiinile 1 ml esperaasilahust, loksutan kergelt ja võtan võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu, mis on 0-prooviks, ja viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Loksutan läbi ja jätan sademe settima. Kaseiini asetan tagasi termostaati 5 minutiks. Kordan sama operatsiooni 5-minutiliste intervallidega veel 3 korda. Jätan katseklaasid proovidega umbes 10-15 minutiks täielikuks sadestumiseks seisma. Panen valmis 4 puhast katseklaasi koos plastlehtrite ja paberfiltritega
Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml. Edasi tehakse ettevalmistusi ensüümireaktsiooniks. 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiini lahust (substraat). Katseklaasile pannakse peale kork ning asetatakse see vesitermostaati 510 minutiks soojenema. Samal ajal võetakse 4 kuiva katseklaasi, nummerdatakse need ning pipeteeritakse igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeritakse juurde 1 ml valmistatud alkalaasi töölahust. Reaktsioonisegu loksutatakse läbi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse kellaaeg. Võimalikult kiirelt pipeteeritakse kuiva puhta pipetiga 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Katseklaasi loksutatakse hoolega. Suurem katseklaas reaktsiooniseguga asetatakse kiirelt tagasi vesitermostaati.
kontsentratsiooniga lahusega. Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml. Edasi tehakse ettevalmistusi ensüümireaktsiooniks. 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiini lahust (substraat). Katseklaasile pannakse peale kork ning asetatakse see vesitermostaati 5-10 minutiks soojenema. Samal ajal võetakse 4 kuiva katseklaasi, nummerdatakse need ning pipeteeritakse igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni – kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeritakse juurde 1 ml valmistatud alkalaasi töölahust. Reaktsioonisegu loksutatakse läbi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse kellaaeg. Võimalikult kiirelt pipeteeritakse kuiva puhta pipetiga 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Katseklaasi loksutatakse hoolega. Suurem katseklaas reaktsiooniseguga asetatakse kiirelt tagasi vesitermostaati. Täpselt viie minuti pärast võetakse uuesti sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ja
Kus: C1-taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, 2,0 mg/mL C2-taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T(10 min või 20 min pärast ensüümreaktsiooni algust) võetud proovis, 6,0 mg/mL ja 11,0 mg/mL V1-reaktsioonisegu üldmaht, mL- 26 mL V2- ensüümi töölahuse üldmaht, 5 mL 103-tegur üleminekuks mikrogrammidele T-hüdrolüüsi kestus, 600 s ja 1200 s 180-glükooosi molekulmass, V3-proovi maht taandavate suhkrute määaramiseks, 1 mL V4-ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, 1 mL G-ensüümipreparaadi kaalutis, 0,01 g 5 Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena.Selleks arvutasin katseandmete alusel ensüümi aktiivsus A10 kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 10. minutit(T=10 min=600 s) võetud proovis ja A20, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus
Arvutus viiakse läbi vastavalt valemile: kus C1- taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml C2- taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml V1- reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml 103- tegur üleminekuks mikrogrammidele L- lahjendusmäär, mida kasutatai vedelast ensüümipreparaadist töölahuse valmistamisel T- hüdrolüüsi kestus s 180- glükoosi molekulmass V3 - proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml Tulemused erinevad üksteisest: 62,63 100% 49,11 x% Seega tulemused erinevad üksteisest 100%- 78,41% = 21,59% Kokkuvõte
Pipeteerisin 50 ml-lisesse katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust, pH=8,4. Ensüümikontsentratsioon 1,5 mg/ml. Vajalik kogus=1,5*5=0,0075g. Hüdrolüüs: 1. 50 ml katseklaasi pipeteerida 25 ml 2%-list kaseiini lahust, millel on sobiv pH. Katta korgiga ja asetada vesitermostaati 30 kraadi juurde Celsiuse järgi 5-10 minutiks soojenema. 2. Võtta 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja need nummerdada. Igaühte pipeteerida 3 ml 5%-list TKÄ lahust. 3. Alustada ensüümireaktsiooni kui kaseiini lahus on 30 kraadini soojenenud. Pipeteerida kaseiinile juurde 1 ml proteaasi (sarinaas) töölahust, loksutada kiiresti läbi ja asetada termostaati tagasi. Fikseerida aeg kellaga või käivitada stopper. Võtta 0 proov: 3 ml reaktsioonisegu lisada esimesse TKÄ-ga katseklaasi ning loksutada kiiresti läbi. Kaseiini ja proteaasiga katseklaas panna kiiresti tagasi termostaati. Kell: 9:19 4. Viie minuti pärast võtta sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ning
annaabi.ee 
