TTÜ Biokeemia praktikum: Proteaas (0)

TÖÖ 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

Juhendajad:
Kaia Kukk
Priit Eek
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke.
Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide.
Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid.
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid.
Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0).
Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool -, aspartaat- ja metalloproteinaasideks.
Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise . Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

• Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi (leelisproteaas, pH 8,4)
  
• Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 7,6 mg (soovitatav oli 7,5 mg) ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4)
  
• Lahus tehakse 10 ml graduleeritud katseklaasi
  

Ensüümireaktsiooni läbiviimine

• Võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2% kaseiini lahust pH 8,4 juures
  
• Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 kraadi juurde 10 minutiks
  
• Võetakse 4 kuiva katseklaasi ja nummerdadakse
  
• Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5% TKÄ lahust
  
• 10 min möödudes pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi lahust, reaktsioonisegu loksutatakse ja asetatakse termostaati tagasi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg
  
• Peale proteaasi lisamist võetakse kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ning viiakse see esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutatakse
  
• Toimingut korratakse 5, 10 ja 15 minuti möödudes reaktsiooni algusest
  

Reaktisooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

• Proovidega katseklaasid jäetakse 15 minutiks sademe formeerumiseks seisma
  
• Proovidega katseklaaside sisud filtreeritakse kuivadesse katseklaasidesse
  
• Kontrollitakse, et filtraadid on täiesti selged
  
• Proovide optilised tihedused määratakse spektrofotomeetril lainepikkusel 280 nm
  
• Vastavalt saadud väärtustele leitakse kaliibrimissirgelt türosiini kontsentratsioonid
  
• Koostatakse graafik , mis väljendab türosiini kontsentratsiooni sõltuvust ajast
  
• Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv valitud ajavahemikus
  
• Arvutatakse ensüümipreparaadi aktiivsus
  

Türosiini juurdekasv on 0,0044

• ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus ajavahemikus,
  
• Δt – valitud ajavahemik , 1 min = 60 s
  
• V1 – reaktsioonisegu üldmaht, 26 ml
  
• V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht, 5 ml
  
• V3 – proovi maht hüdrolüüsisegus, 1 ml
  
• g – proteaasi preparaadi kaalutis , 7,6 mg = 0,0076 g
  

Järeldus: Praktilise töö käigus õnnestus määrata kasutatava alkalaasiproovi aktiivsus, milleks on 13,8606 mikrokatalit grammi kohta. See tähendab, et 1 gramm alkalaasi hüdrolüüsib ühe sekundiga 30 kraadi juures 13,8606 mikromooli peptiidsidemeid Kaod võisid tekkida näiteks ensüümi ülekandmisel mõõteklaasist katseklaasi, või liiga vara reaktsioonisegust võetud proovide tõttu.