3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll (2)

Tallinna Tehnikaülikool
3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Biokeemia labori protokoll

2011

Töö teoreetilised alused

Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Seejuures nad produtseerivad madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid .
Proteaase on kõikides organismides, sest nad täidavad füsioloogilisi funktsioone, sealhulgas katalüüsides toiduvalkude seedimist ja kõrgeltreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaade.
Proteolüütiliste ensüümide esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Osa lõhustavad eelistatult spetiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (s.o. piiratud proteolüüs) ja teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (s.o piiramatu proteolüüs).
Piiratud proteolüüsi puhul lõhustavad proteaasid vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, seda viivad läbi trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin . Piiramatul proteolüüsil toimivad proteaasid kõikidele peptiidsidemetele. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid. Eristatakse endo - ja eksopeptidaase sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiididele. Endopeptidaasid on trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, subtilisiin, savinaas, alkalaas. Eksopeptidaaside esindajateks on karbosküpeptidaasid ja aminopeptidaasid. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH=2,5), neutraalseid (pH=7,2) ja leelisproteaase (pH=9,0).
Proteaasi aktiivsuse määramine põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid , mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja tänu sellele on spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (A v D) uuritavas lahuses.

Katse käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

Valmistasin uuritavast proteaasi preparaadist, milleks oli savinaas, ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse, milles ensüümi kontsentratsioon oleks vahemikus 1-5 mg/mL.
Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel 0,0080 g ehk 8 mg savinaasi, panin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin puhverlaust. Segasin lahust senikaua , kuni ensüüm oli täielikult lahustunud.

Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtsin 50 mL mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli eelnevalt reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Sulgesin katseklaasi korgiga ja panin vesitermostaati 30⁰ C juurde u 10 minutiks soojenema.
Võtsin 4 kuiva katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipeteerisin igasse katseklaasi 3 mL 5%-list TKÄ lahust.
Pärast kaseiinilahuse soojenemist, alustasin ensüümireaktsiooni. Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 mL valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin ning võtsin puhta kuiva pipetiga kiiresti 3 mL reaktsioonisegu, mille viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, loksutasin. See oli 0- proov .
Reaktsioonisegu asetasin termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ka reaktsiooni alguse aja stopperil.
5 minuti pärast võtsin sama pipetiga jälle 3 mL reaktsioonisegu ja panin teise katseklaasi, loksutasin läbi. Reaktsioonisegu panin jälle tagasi termostaati.
Samamoodi toimisin ka 10-ndal ja 15-ndal minutil. Sedasi sain 4 katseklaasi, milles oli 5-minutiliste intervallidega võetud reaktsioonisegud TKÄ-s.
Pärast viimase proovi võtmist võtsin katseklaasi termostaadist välja.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Proovidega katseklaasid jätsin täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma.
Panin valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning asetasin neile plastlehtrid filterpaberiga.
Filtrisin proovid kuivadesse katseklaasidesse, teades, et filtrile jäänud sade pole vajalik. Saadud filtraadid olid täiesti selged (kui nad seda poleks olnud, oleks tulnud uuesti filtrida).
Määrasin spektrofotomeetril nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel λ = 280 nm (D280), kasutades selleks 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.
Leidsin kaliibrimisgraafikult vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni ning saadud katseandmete põhjal koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t).
Tabel 1. Katsetulemused
Joonis 1. Türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kiiruse vaheline sõltuvus, CTyr = f(t)
Arvutasin ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse A (μkat/g) vastavalt valemile:
kus:
ΔC(Tyr) – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus , mg/ml
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik , s
V₁ - reaktsioonisegu ( substraat +ensüüm) üldmaht, ml
V₂ - valmistatud ensüümilahuse üldmaht, ml
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus
V₃ - ensüümi maht hüdrolüüsisegus, ml
g – proteaasi preparaadi kaalutis, g
181 – türosiini molekulmass

Järeldus

Proovid said võetud reaktsioonisegust kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis , mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitses lineaarne sõltuvus. Seega peavad kõik neli punkti katse korralikul läbiviimisel langema ühele sirgele.
Minu tehtud katse õib lugeda õnnestunuks, sirge läbib peaaegu kõiki punkte, kõrvalekalle on väga väike.