Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia praktikumi laboratoorne töö
3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Üliõpilane: Liis Hendrikson
Matrikli nr: 104191
Õpperühm: KATB 41
Juhendaja : Tiina Randla
3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Töö teoreetilised alused:
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises (nt vere hüübimise kaskaad).
Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs).
Piiratud proteolüüsi viivad läbi ka produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid:

• Trüpsiin
  
• Kümotrüpsiin
  
• Pepsiin
  

Paljud bakteriaalsed proteaasid (nt subtilisiin, savinaas, alkalaas ) omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid.
Eristatakse endo ja eksopeptidaase, vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Kõik üleval pool nimetatud proteaasid on endopeptidaasid. Eksopeptidaasid on karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid, mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid , neutraalseid
ja leelisproteaase .
Oluline proteaaside klassifikatsiooni aspekt on aktiivtsentri ehitus (millised aminohapped sellesse kuuluvad) ja sellest tuleneb ensüümi toimemehhanism.
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühik on selline ensüümi hulk, mis põhjustab
peptiidsidemete hüdrolüüsi või
aminohapete vabanemise
vältel
juures.
Üldlevinud on, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina reeglina kaseiini . Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin. Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na-sool. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Reaktsioonisegu sisaldab siis peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV piirkonnas lainepikkustel
ja tänu sellele on nad spektofotomeetriliselt hästi detekteeritavad.
Joonis 1. Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete neeldumisspektrid.
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik:
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

• Uuritavast proteaasi preparaadist valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus .
  
• Arvutasin välja ensüümipreparaadi kaalutise suuruse.
  

Minu katses kasutatud ensüüm oli alkalaas. Tehtava töölahuse täpne maht on
ja ensüümi kontsentratsioon selles .

• Analüütilistel kaaludel kaalusin sobiva suurusega kaaluklaasi vajaliku koguse ensüümipreparaati ja viisin kadudeta (kvantitatiivselt) lahuse valmistamiseks gradueeritud katseklaasi.
  

Kaalutis = 0,0074 g

• Lisasin väikese koguse puhverlahust ja segasin klaaspulgaga umbes 5 min kuni ensüüm on lahustunud.
  

Ensüümipreparaat lahustus peaaegu täielikult, sest see sisaldas ka täiteainet, mis ei lahustunud. Seepärast tekkinud lahus ei olnud täielikult selge.

• Seejärel täitsin klaasi puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutasin läbi, et ensüümi kontsentratsiooni lahuses ühtlustada.
  

Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine

• Võtsin 50 ml mahuga suur katsekaas, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele.
  
• Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati juurde umbes 5 – 10 minutiks soojenema.
  
• Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin.
  
• Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
  
• Kui kaseiini lahus on -ni soojenenud, alustasin ensüümireaktsiooni – kaseiini hüdrolüüsi.
  
• Pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, reaktsioonisegu loksutasin kiiresti läbi.
  
• Fikseerisin alguse aja kella järgi.
  
• Peale ensüümi lisamist võtsin kiiresti puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu, viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov ) ja klaasi sisu loksutasin hoolega.
  
• Asetasin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaati tagasi.
  
• Täpselt 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja klassi sisu loksutasin hoolega läbi.
  
• Sama operatsiooni kordasin 5-minutiliste intervallidega veel 2 korda, s.t ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil.
  
• Peale viimase proovi võtmist võtsin reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist välja.
  

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

• Proovidega katseklaasid jätsin täielikuks sademe formeerumiseks 10 – 15 minutiks seisma.
  
• Sel ajal panin valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustasin need sobivate väikeste klaas- või plastlehtrite ning paberfiltritega.
  
• Proovid , millesse oli sade põhja settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse.
  

Igasse katseklaasi oli ohtralt sadet sisse formeerunud, seega filtrisin iga katseklaasi sisu 1 korra. Saadud filtraadid olid täiesti selged.

• Spektrofotomeetril määrasin nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel , kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.
  
• Kaliibrimisgraafikult leidsin vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni .
  

Tulemused ja nende interpreteerimine:
Katsetulemused
Optilised tihedused :
Kaliibrimisgraafikult vastavad türosiini kontsentratsiooni väärtused :
Türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vaheline sõltuvus
Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis , mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peaksid 4 punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele.
Minu katses nagu graafikult näha katsepunktid päris sirgele ei lange, kuid õnneks ei paikne need ka väga kaugelt antud sirgest.
Kõiki katsepunkte arvestava sirge järgi leian graafikult türosiini juurdekasvu
valitud ajavahemikus .
Graafikult:
Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus
arvutatakse vastavalt valemile:
Kus: türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus,
hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik ,
reaktsioonisegu ( substraat +ensüüm) üldmaht,
valmistatud ensüümilahuse üldmaht,
TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus
ensüümi maht hüdrolüüsisegus,
proteaasi preparaadi kaalutis,
türosiini molekulmass
Järeldused:
Alkalaasi proteolüütiline aktiivsus oli minu katse tulemusena , s.t et 1 sekundi jooksul hüdrolüüsiti
juures
peptiidsidemeid.