Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Laboratoorne töö IV
Üliõpilane: Meelika Lukner (155308)
Kuupäev: 08.04. 2016
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Proteolüütilised ensüümid (ka proteaasid , proteinaasid või peptidaasid) on ensüümid, mis katalüüsivad proteolüüsi. Proteolüüs on peptiidsidemete hüdrolüüs valkudes ja peptiidides, mille tulemuseks on madalama molekulmassiga peptiidid ja aminohapped . Kuna proteaas täidab väga paljusid füsioloogilisi funktsioone, leidub seda kõikides organismides.
Mõned protelüütilised ensüümid lõhustavad spetsiifilisi peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), mida viivad läbi näiteks trüpsiin , kümotrüpsiin ja pepsiin , ja mõned lõhustavad kõiki peptiidsidemeid (piiramatu proteolüüs), milleks on näiteks paljud bakteriaalsed proteaasid nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt.
Proteaase jagatakse ka selle alusel, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele – endo-ja eksopeptidaasid.
Ensüümi toimimise järgi jaotuvad need hapudeks (pH=2,5), neutraalseteks (pH=7,2) ja leelisproteaasideks (pH=9,0).
Aktiivtsentri ehitusest tuleneb ensüümi toimemehhanism. Neli peamist rühma on seriin-, tiool -, aspartaat- ja metalloproteinaasid.
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 µmooli aminohapete vabanemise 1 s vältel 30°C juures. Aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Proteaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina kaseiini , mis on piima põhivalk ja kus ta asub mitsellidena. Vees see ei lahustu, küll aga lahustub selle valgu Na-sool. Aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, kui valgus on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. See tähendab, et valk on suures osas hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja trikloroäädikhappega ( TKÄ ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadenevad TKÄ toimel ning ensüüm inaktiveerub ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja peptiidid. Nende kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel: fenüülalaniin (Phe), türosiin (Tyr) ja trüptofaan (Trp). Nad omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm ja on tänu sellele spektrofotomeetriliselt kenasti dekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse aga siiski vaid türosiini kontsentratsioonina mg/mL olemasoleva kaliibrimissirge alusel.
Töö käik
Valmistan juhendaja näpunäidete järgi sobiva pH-ga esperaasi lahuse, kasutades lahustiks atsetaatpuhvrit. Optimaalne kontsentratsioon esperaasi jaok on 4 mg 1 ml puhvri kohta, seega pean 5 ml lahuse jaoks kaaluma 20 mg ehk 0, 0200 g esperaasi analüütilisel kaalul. Seejärel lisan väikese koguse puhverlahust ja segan klaaspulgaga, kuni ensüüm on lahustunud (kuna preparaat sisaldab ka täietainet, mis ei lahustu, siis selget lahust ei teki). Viin mahu 5 ml-ni ja loksutan lahuse läbi, et kontsentratsioon ühtlustuks.
Võtan 50 ml-se katseklaasi ja pipeteerin sinna 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Panen katseklaasile korgi peale ning asetan termostaati 30oC umbes 5-10 minutiks.
Kuni substraat soojeneb, võtan 4 kuiva 20 ml katseklaasi ja nummerdan. Pipeteerin igaühte neist 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
Pärast kaseiini soojenemist alustan ensüümireaktsiooni. Pipeteerin kaseiinile 1 ml esperaasilahust, loksutan kergelt ja võtan võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu, mis on 0-prooviks, ja viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Loksutan läbi ja jätan sademe settima. Kaseiini asetan tagasi termostaati 5 minutiks. Kordan sama operatsiooni 5-minutiliste intervallidega veel 3 korda.
Jätan katseklaasid proovidega umbes 10-15 minutiks täielikuks sadestumiseks seisma. Panen valmis 4 puhast katseklaasi koos plastlehtrite ja paberfiltritega. Kui sademed on põhja settinud, filtrin selged lahused kuivadesse katseklaasidesse. Kui mõni lahus on pärast filtrimist veel hägune, filtrin seda lahust uuesti.
Määran nende nelja proovi optilise tiheduse väärtused spektrofotomeetria meetodil lainepikkusel 240 nm. Kasutan 1 cm läbimõõduga kvartsküvette. Saan järgmised tulemused.
0- proov
0,2461
5:20 min
0,2749
10:20 min
0,3942
15:15 min
0,4556
Leian vastavalt nenedele optilistele tihedustele türosiini kontsentratsiooni (mg/mL) kaliibrimisgraafikult.
Proovi t (s)
CTyr (mg/mL)
0
0,039
320
0,045
620
0,063
915
0,072
Kannan tulemused graafikule.
Arvutan ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse A vastavalt valemile:
A = = = 2,49 μkat/g
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/mL)
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s)
V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml)
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml)
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml)
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g)
181 – türosiini molekulmass
Järeldus
Türosiini kontsentratsiooni ja aja vaheline sõltuvus tuli antud katses välja lineaarsele lähedane , seega võib katse lugeda õnnestunuks. Ensüümipreparaadi protelüütiliseks aktiivsuseks A esperaasile sain 2,49 μkat/g.