3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4) on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassida peptiide ja vabu aminohappeid .
Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemele (piiramatu proteolüüs).
Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid:

• Trüpsiin (R1 = Lys, Arg; R2 ≠ Pro)
  
• Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Lei, Ile, Val; R2 ≠ Pro)
  
• Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 ≠ Pro).
  

Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma.
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH ≅ 2,5), neutraalseid (pH ≅ 7,2) ja leelisproteaase (pH ≅ 9,0).
Olulisekd proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism.
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 μkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 μmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 μmooli aminohapete vabanemise 1 s vältel 30°C juures.
Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina reeglina kaseiini . Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin. Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trokloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid , mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel.
Reaktsioonisegus võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkuseda valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg/ml või μmol/ml (1 μmol = 181 μg = 0,181 mg).
Töö käik:
Ensüümiprepadaadist töölahuse valmistamine
Uuritavast proteaasi preparaadist valmistan lahus, milles ensüümi kontsentratsioon võrdub 1,5 mg/ml.
Ensüümina kasutan savinaasi.
Analüütilistel kaaludel kaalun 7,5 mg ensüümi. Minu kaalutis on 0,0081 g.
Viin kadudeta ensüümi gradueeritud katseklaasi ja lisan väike kogus puhverlahust.
Segan klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud.
Seejärel lisan puhverlahust 5 ml-ni ja loksutan läbi.
Ensüümreaktsiooni läbiviimine
Võtam 50ml-line katseklaas , kuhu pipeteerin 25 ml 2%-list kaseiini lahust,
Klaas katan korgiga ja asetan vesitermostaati 30°C juures umbes 5-10 minutiks soojenema.
Võtan 4 kuiva katseklaasi ja nummerdan neid.
Igaühte pipeteerin 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
Kui kaseiini lahus on soojenenud, pipeteerin temale juurde 1 ml savinaasi töölahust, kiiresti loksutan reaktsioonisegu läbi ja fikseerin reaktsiooni alguse aeg. Võimalikult kiiresti võtan puhta kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, viin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov ) ja loksutan hoolega.
Peale proovi võtmist asetan reaktsiooniseguga katseklaas tagasi termostaati.
Täpselt 5 minuti pärast võtan saa pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja klaasi sisu loksutan hoolega läbi.
Sama operatsiooni kordan veel 2 korda, s.t. ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Proovidega katseklaasit jätan 15 minutiks sademe formeerumiseks.
Sel ajal panen valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustan neid väikeste plastlehtrite ning paberfiltritega.
15 minuti pärast filtrin kuivadesse katseklaasidesse. Saadud filtraadid on täiesti selged.
Spektrofotomeetril määran nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel λ = 280 nm (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.
Minu tulemused:

0,310 A

0,436 A

0,523 A

0,747 A
Kaliibrimisgraafikult leian vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsioon.
Türosiini kontsetratsioon :

C = 0,049 mg/ml

C = 0,069 mg/ml

C = 0,083 mg/ml

C = 0,119 mg/ml
Türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse sõltuvus CTyr = f(t)
Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus A (μkat/g):
kus:
∆CTyr – türosiini kontrentsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml);
∆t – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s);
V1 – reaktsioonisegu ( substraat + ensüüm) üldmaht (ml);
V2 – valmistatud ensüümlahuse üldmaht (ml);
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml);
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus;
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g);
181 – türosiini molekulmass .
5 min:
10 min:
15 min:
Järeldus:
Katse tulemustel võib järeldada, et valgus toimus aminohapete vahel peptiidsidemete hüdrolüüs. Õnnestus valgule proteaasiga toimida, TKÄ-ga neid sadestama ning hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrata spektrofotomeetrilisel meetodil.
Koostatud graafik CTyr = f(t) peab vastama lineaarsele sõltuvusele, st kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul peavad langema sirgele. Minu juhul need väärtused ei lange täpselt sirgele. See võib olla tingitud suurema ensüümi massi kaalumisega töö algusel, mille tõttu kõik katse tulemused muutusid.