Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia
Laboratoorne töö 3.2
Teostaja :
2016

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid , on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke.
Erinevad proteaasid omavad ka erinevat toimespetsiifikat. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs ). Sellised on näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin, mis produtseerivad põhiliselt peptiide. Samas paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu näiteks subtilisiin, savinaas, alkalaas, omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid ning produtseerides vabu aminohappeid (piiramatu proteolüüs).
Olenevalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse vastavalt endo- ja eksopeptidaase. Kõik eelnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside hulka. Eksopeptidaasid on karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid, mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0). Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool -, aspartaat- ja metalloproteinaasideks.
Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks on 1 µkat, mis väljendab sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 µmooli aminohapete vabanemise 1 sekundi vältel 30°C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis on üldlevinud, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide ehk aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina tavaliselt kaseiini . Kaseiin on piima põhivalk, mis on koostiselt fosfoproteiin. Kaseiin esineb piimas mitsellidena, sest omab kõrget hüdrofoobsust. Piimast eraldatud kaseiin enamjaolt vees ei lahustu. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka edasise hüdrolüüsi. Pärast sademe eraldamist jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270–280 nm, tänu millele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsalt detekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml, kusjuures 1 µmol = 181µg = 0,181 mg. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides

Töö käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Alkalaasi preparaadist valmistasin ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse. Arvutasin, et 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 10 mg alkalaasi preparaati. Analüütilisel kaalul sain kaalutiseks 10,7 mg. Viisin ensüümipreparaadi kadudeta katseklaasi. Lisasin 5 ml boraatpuhvrit, mille pH oli 8,4. Segasin lahust klaaspulgaga, et ensüüm lahustuks. Kuna preparaadid sisaldavad ka täiteainet, siis selget lahust ei tekkinud.

Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi läbiviimine

50 ml mahuga katseklaasi pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi ja nummerdasin nad. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu kiiresti läbi ning võtsin puhta ja kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, mille lisasin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Peale proovi võtmist asetasin reaktsiooniseguga katseklaasi tagasi termostaati. 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga uuesti 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja loksutatakse klaasi sisu hoolega läbi. Sama protseduuri kordasin 5-minutiliste intervallidega veel kaks korda, see tähendab ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Proovidega katseklaasid jätsin sademe täielikuks moodustamiseks veel 10 minutiks seisma. Proovid, milles sade oli põhja settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse. Saadud filtraadid olid täiesti läbipaistvad. Neljal erineval ajahetkel reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel λ = 280 nm määrasin spektrofotomeetril. Selleks kasutasin 1 cm läbimõõduga kvartsküvette. Vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele leidsin neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni kaliibrimisgraafikult. Saadud katseandmete alusel koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni sõltuvust reaktsiooni kestvuse ajast CTyr = f(t).
Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel kehtib lineaarne sõltuvus , siis peaksid kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele. Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, sest kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0- proov sisaldas veidi türosiini. Katsepunktide hajumise korral viiakse neist läbi kõiki katsepunkte arvestav sirge.
Aeg (min)
Optiline tihedus (D)
Türosiini kontsentratsioon (C, mg/ml)
0
0,2952
0,047
5
0,4346
0,067
10
0,4515
0,072
15
0,6098
0,096
Proteolüütiline aktiivsuse leidmine
(µkat/g)
= 6,489 µkat/g
See tähendab, et 1 gramm alkalaasi hüdrolüüsib ühe sekundi jooksul 30 °C juures 6,489 mikromooli peptiidsidemeid.
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus, 0,029 mg/ml
Δt – valitud ajavahemik, 10 min = 600 s
V1 – reaktsioonisegu üldmaht, 26 ml
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht, 5 ml
TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2)
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus, 1 ml
g – alkalaasi preparaadi kaalutis , 10,7 mg = 0,0107 g
Türosiini molekulmass 181