Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia instituut
BIOKATALÜÜS
3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Juhendaja : Tiina Randla
Töö teoreetilised alused
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidide, produtseerides madala molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaasi leidub kõigis organismides, kuna nad osalevad erinevate funktsioonide täitmises. Näiteks toiduvalkude seedimises ja kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadides.
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase:

• Eksopeptidaasi esindajateks on karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid- need lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
  
• Endopeptidaasideks on näiteks savinaasi, alkalaasi –omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid.
  

Ensüümi toimimiseks optimaalne keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (ph~2,5), neutraalseid (pH~7,2), leelisproteaase (pH~9).
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsi uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevaid hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilistel meetoditel .
Reaktsioonil võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Kasutades olemasolevaid kalibrimissirgeid leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

• Pidin valmistama 5 mL lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/mL. Minu poolt uuritavaks proteaasi preparaadiks oli Alcalase. Kaalusin analüütilisel kaalul 7,1 mg uuritavat proteaasi ja viisin selle kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. Järgnevalt lisasin uuritavale ainele boraatpuhvrit (pH=8,4), esialgu väiksema koguse.
  
• Järgnevalt segasin gradueeritud katseklaasi segu 5 minuti vältel, et ensüüm lahustuks. Selgelt lahust seejuures ei tekkinud, sest uurisin tehnilist ensüümipreparaati, mis lisaks ensüümivalkudele sisaldab ka muid valke ja täiteaineid.
  
• Hiljem viisin katseklaasis oleva lahuse sobiva mahuni, milleks oli 5 mL ja lisasin katseklaasile korgi ja loksutasin seda, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks.
  

Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

• Võtsin 50 mL lahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin pipetiga 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Asetasin katseklaasile korgi ja asetasin eelnevalt soojendama pandud vesitermostaati 30°C juurde 10ks minutiks soojenema.
  
• Järgnevalt nummerdasin 4 kuiva katseklaasi ja pipeteerisin igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust.
  
• Pärast kaseiini soojendamist võtsin ta termostaadist välja ja alustasin kaseiini hüdrolüüsi. Alguses pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu kiiresti ja viisin 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutasin seda. Ja asetasin reaktsioonisegu kiirelt termostaati tagasi.
  
• 5. minuti pärast võtsin 3 ml teise katseklaasi ja loksutasin sisu. Seda kordasin veel kaks korda- 10. ja 15. minutil.
  
• Selle tulemusel tekkis mul nelja katseklaasi valge lund meenutav sade. Sade vajus seistes põhja. 0- proov sisaldas vähem sadet, 15-proovis tekkis rohkem sadet.
  
• Proovidega katseklaasid jätsin 10-15 minutiks sadenema.
  

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

• Panin valmis 4 plastiklehtrit ja voltisin vajalikus suuruses filterpaberid ning võtsin 4 puhast ja kuiva katseklaasi, millele tegin vastavad märgised.
  
• Pärast sademe põhja settimist, filtrisin proovid kuivadesse katseklaasidesse ja kontrollisin, et filtrides sadet puhtasse katseklaasi ei läinud – minu katseklaasid jäid selgeks.
  
• Järgnevalt valisin spektofotomeetrilt vajamineva lainepikkuse – 280 nm (D20) ja pesin ära 1 cm läbimõõduga kvartsküveti. Ettevaatlikult kallasin proovi kvartsküvetti ja panin selle spektofotomeetrisse. Nii tegin ka ülejäänud kolme prooviga ja sain järgmised tulemused:
  

Proov
Optiline tihedus (ABS)
Türosiini kontsentratsioon (mg/mL)
Ajahetk (s)
0-proov
0,454
0,0780
30
5-proov
0,624
0,1000
300
10-proov
0,732
0,1160
600
15-proov
0,832
0, 1330
900
Arvutan ensüümipreparaadi proteolüütiliseaktiivsuseA(µkat/g)
∆CTyr-türosiini kontsentratsiooni muutusvalitudajavahemikus (mg/ml)
∆t- hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s)
V1- reaktsioonisegu ( substraat + ensüüm) üldmaht (ml)
V2-valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml)
2-TKÄ lahusesr tingitud proovilahjendus
V3-ensüümi maht hüdrolüüsisegus
g-proteaasi preparaadi kaalutis (g)
181- türosiini molekulmass
=12,36 µkat/g
Katse järeldus
Selle katse käigus pidin võtma proove nii, et kontsentratsiooni ja aja vahel valitseks lineaarne sõltuvus. Sellisel juhul peaks katse tulemused olema ühel lineaarsel sirgel, minu katses taolist sirget ei tekkinud, seega pole minu tulemused lineaarsed . Viga võis tekkida sellest, et pole piisavalt kogemust ja kiirust, et reaktsioonisegu viia TKÄ ja siis uuesti kähku termostaati tagasi.