Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Töö nr 3.2
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Koostas:
Juhendaja : Mart Reimund
Teoreetilised alused
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid – ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid .
Proteaasid on laialt levinud organismides, sest nad osalevad mitmete füsioloogiliste rollide täitmisel.
Eristatakse proteolüütilisi ensüüme, mis toimivad kõikidele peptiidsidemetele ja on ka spetsiifilisi, mis lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (nn piiratud proteolüüs, nt trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin).
Eristatakse ka endo- ja eksopeptidaase, vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele.
Optimaalse pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase.
Oluline klassifikatsiooni aspekt on ka aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev toimemehhanism, 4 peamist rühma on: seriin -, tiool-, aspartaat - ja metalloproteinaasid.
Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide kaudu.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ning trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel, milleks kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit.
TKÄ toimel sadestuvad lahusest tervikvalgud ning kõrgmolekulaarsed peptiidid , sademe eraldamisel jäävad lahusesse alles aga vabad aminohapped ning madalmolekulaarsed peptiidid – nende kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse algusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped nagu Tyr, Trp ja Phe omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm ning selle tõttu on nad kergesti tuvastatavad spektrofotomeetriliselt.
Antud katses väljendatakse kaseiini hüdrolüüsiproduktide sisaldus türosiini kontsentratsiooniga . Kasutades kaliibrimissirget, leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon.
Töö käik
Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine
Valmistada proteaasi preparaadist sobiva pH väärtusega puhvris lahus, ensüümi (antud juhul alkalaas ) kontsentratsioon peaks olema lahuses 1-5 mg/ml, antud katses oli ensüümi kontsentratsiooniks 1,56 mg/ml (kaalutis 7,8mg). Kui ensüümpreparaadile on väike kogus puhverlahust lisatud, segada lahust klaaspulgaga u 5 min, kuni ensüüm lahustub. Seejärel täita klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutada kõik läbi.
Ensüümireaktsiooni läbiviimine
Võtta 50 ml katseklaas ning pipeteerida sinna 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Sulgeda klaas korgiga ning jätta 30 kraadi juurde soojenema 5-10 minutiks.
Võtta ja nummerdada 4 kuiva tavalist katseklaasi ning pipeteerida neisse 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustada ensüümireaktsiooni: selleks pipeteerida kaseiini sisaldavasse katseklaasi 1 ml proteaasi töölahust, loksutada, fikseerida aeg. Peale ensüümi lisamist kohe võtta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viia see esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0- proov ), loksutada. Reaktsiooniseguga katseklaas viiakse tagasi termostaati.
5 minuti pärast võtta sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi, loksutada. Sama tegevust korrata veel ensüümireaktsiooni 10. ja 15. minutil.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
Proovidega katseklaasid jätta 10-15 minutiks seisma, et tekiks korralik sade. Panna valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustada need lehtrite ja paberfiltritega.
Proovid filtritakse , kusjuures sade peab olema täiesti selge ning filtrile jäänud sade pole enam vajalik.
Spektrofotomeetril määratakse nelja erineva proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel 280 nm, kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.
Tulemused:
0-proov
A= 0,539
CTyr – 0,085 mg/ml
5 min proov
A= 0,651
CTyr – 0,103 mg/ml
10 min proov
A= 0,779
CTyr – 0,124 mg/ml
15 min proov
A= 0,945
CTyr – 0,151 mg/ml
A= (∆CTyr * 103 * V1 * V2 * 2) / ∆t * 181 * V3 * g
∆CTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml) (0,061 mg/ml)
V1 – reaktsioonisegu üldmaht (26ml)
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (5ml)
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus
∆t – hüdrolüüsi kestus (900s)
181 – türosiini molekulmass
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (1 ml)
G – proteaasi preparaadi kaalutis, g (0,0078g)
Kui arvutada ilma graafikuta:
A= (∆CTyr * 103 * V1 * V2 * 2 )/ ∆t * 181 * V3 * g =
=(0,066 * 1000 * 26 * 5 *2)/900*181*1*0,0078= 13,51 µkat/g
Nüüd panen katseandmed graafikule ning teen arvutuse uuesti. Ideaalis peavad kõik neli punkti graafikul langema sirgele, kui katse on korrektselt läbi viidud .
Aeg, min
CTyr, mg/ml
Aeg, min
Võtan graafikult ∆CTyr väärtuse, ∆CTyr= 0,061 mg/ml
A= (∆CTyr * 103 * V1 * V2 * 2 )/ ∆t * 181 * V3 * g =
=(0,061 * 1000 * 26 * 5 *2)/900*181*1*0,0078= 12,48 µkat/g
Antud katses väljendab ensüümi aktiivsus 12,48 µkat/g seda, et 1 g preparaati põhjustab 12,48 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 12,48 µmooli aminohapete vabanemise 1 s vältel 30 ◦C juures.
Järeldus
Kuna mul polnud võimalik oma arvutustulemust mingi konkreetse arvuga võrrelda, siis ei saanud ma ka veaarvutust teha. Küll aga on graafik üpris lineaarne ning sellest võin järeldada, et sooritasin katse edukalt.