Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (1)

Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö nr.3.2
Anna Logunova YAGB-22
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Teooria
Proteolüütilised ensüümid ehk on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides ,produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid .
Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs).
Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid :
• Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 ≠ Pro)
• Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 ≠ Pro)
• Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 ≠ Pro)
Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad
väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid,
produtseerides vabu aminohappeid.
Proteaas
Endopeptidaas-toimib polüpeptiidahela kesksetele peptiidsidemele.
Eksopeptidaas-toimib polüpeptiidahela otsmisele peptiidsidemele. karboksüpeptidaasid (R2 = Cterminaalne
aminohape ) ja aminopeptidaasid (R1 = N- terminaalne aminohape),
lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid.
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH≅2,5), neutraalseid (pH ≅ 7,2) ja leelisproteaase (pH ≅ 9,0).
Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse
substraadina reeglina kaseiini . Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin.Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na-sool (Na-kaseinaat).
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi
toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide
sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid , mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi.
Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja
fenüülalaniin (Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270–280
nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.
Töö käik
Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
Uuritavast ensüümipreparaadist (Alcalase) valmistan 8,2 pH väärtusega puhverlahus ,milles ensüümi kontsentratsioon on 1 mg/ml ja kogu lahuse maht on 5 ml.
Ensüümi kontsentatsioon on 1 mg/ml ,lahuse maht on 5 ml tuleb kaaluda analüütilisel kaaludel 5 mg (0,005 g) Alcalase.
Selleks,et valmistada töölahust tuleb:

• loputada kaaluklaasi 8,2 pH väärtusega puhverlahusega
  
• kaaluda analüütilise kaaludel kaaluklaasi ilma ensüümideta
  
• kaaluda vajalik ensüümi kogus
  
• lisada väike kogus puhverlahust, loksutada hoolikalt
  
• valada kaaluklaasist lahus lahuse valmistamiseks sobiva anumasse (10 ml katseklaas )
  
• lisada kuni 5 ml kriipsuni puhverlahust ja loksutada.
  

Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtan 50 ml mahuga suur katseklaas,kuhu pipeteerin 25 ml 2%-list kaseiini lahust.Klaasi peale panen parafilmi ja asetan vesitermostaati °C juurde umbes 5-10 minutiks soojenema.

Võtan 4 kuiva katseklaasi (20 ml) ja nummerdan.Igaühte pipeteerin 3 ml 5%-list TKÄ lahust.

Kui kaseiini lahus on 30 °C-ni soojenenud,alustan ensüümireaktsiooni-kaseiini hüdrolüüsi. Pipeteerin kaseiinile juurde 1 ml valmistatus proteaasi töölahust,reaktsioonisegu loksutan kiiresti läbi ja asetan termostaati tagasi. Samas fikseerin reaktsiooni alguse aeg.

Kolme minuti pärast võtan puhta kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu,viian esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0 proov ) ja loksutan katseklaasi sisu hoolega.Peale proovi võtmist asetan reaktsiooniseguga katseklaas tagasi termostaati.

Viie minuti pärast( 8-ndal minutil) võtan sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja loksutan hoolega läbi. Sama operatsiooni kordan 5 minutiliste intervallidega veel kaks korda,s.t reaktsioon 13-ndal ja 18-ndal minutil.
Peale viimase proovi võtmist võtan reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist välja.
Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Proovidega katseklaasi jättan täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma.

Panen 4 puhta kuiva katseklaasi valmis ning varustan need plastiklehtrite ja filterpaberitega.

Proovid filtrin kuivadesse katseklaasidesse.Filtrile jäänud sade pole vajalik.

Spektofotomeetril määran nelja erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel λ = 280 nm,kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.
Katse tulemused
Optiline tihedus:

0 proov – esimene katseklaas-3-ndal minutil võetud proov 0,173 ABS

Teine katseklaas- 8-ndal minutil võetud proov 0,198 ABS

Kolmas katseklaas – 13-ndal minutil võetud proov 0,220 ABS

Neljas katseklaas – 18-ndal minutil võetud proov 0,222 ABS (See tulemus ei võtta arvesse,sest see ei ole täpne ja tõenäoline.Selline tulemus tuli välja,sest katseklaasi oli valatud liiga suur või liiga väike kogus reaktsioonisegu,või pärast kolmanda proovi võttmist on möödunud vähe aega.)
Türosiini kontsentratsioon graafiku alusel (mg/ml):

0,028 mg/ml

0,032 mg/ml

0,035 mg/ml

0,037 mg/ml( ei võtta arvesse)
Graafik:
Ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse arvutamine
A = ΔCTyr • 103 • V1 • V2 • 2 / Δt • 181 • V3 • g
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml),
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s),
V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml),
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml),
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2),
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml),
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g),
181 – türosiini molekulmass.
=900(sek)
Järeldus: Katse näitas,et Türosiini kontsentratsioon kasvab reaktsiooni aega suurendamisel.Mida kauem reaktsioon toimub,seda suurem on Türosiini kontsentratsioon.Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus on 44,689μkat/g.
Aeg peab olema sekundites, mitte minutites.
Kui hüdrolüüsisegu maht on 25+1=26ml, siis kuidas saab ensüümi maht hüdrolüüsisegus olla 3ml?