Biokeemia proteolüütilineensüüm (0)

5 VÄGA HEA

PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

Töö teoreetilised alused

Töö eesmärk

Töö eesmärk oli määrata proteolüütilise ensüümi aktiivsus, kasutades substraadina kaseiini ja proteaasi preparaadina alkanaasi. Kasutasin meetodit, kus toimus tänu proteaasile peptiidsideme hüdrolüüsi reaktsioon . Et sadestada põhja kõrgmolekulaarsed ühendid kasutasin trikloroäädikhapet ning mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrasin spektrofotomeetrilisel meetodil.

Teooria

Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid .
Proteolüütiliste ensüümide esindajatel on erinev toimespetsiifika. Mõned lõhustavad spetsiifilisi, teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu protelüüs).
Paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiiin, savinaas, alkanaas jt omavad nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Ka mina kasutasin selles katses sellist proteaasi, alkanaasi.
Kui proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele peptiidsidemetele on tegemist endopeptidaasiga, kui otsmistele, siis eksopeptidaasiga. Selles katses kasutasin endopeptidaasi. Eksopeptidaasid on näiteks karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid, mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N- terminaalseid aminohappeid.
Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH=2,5), neutraalseid (ph=7,2) ja leelisproteaase (pH=9,0).
Proteaase klassifitseeritakse aktiivtsentri ehituse (millised aminohapped sellesse kuuluvad) järgi, millest tuleneb ensüümi toimemehhanism. Neli peamist rühma on seriin -, tiool-, aspartaat - ja metallproteinaasid. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otse mõõdetav, siis on levinud proteaasi aktiivsuse avaldamine valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete peptiidide hulga kaudu.
Alkanaasi aktiivsuse määramisel kasutasin substraadina kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on forfoproteiin. Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na-sool (Na-kaseinaat). Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kasiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Selles etapis sisaldab reaktsioonisegu peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsimata ja on tekkinud ainult vähesel määral vanu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiprodukitde sisalduse määramisel spektrifotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahuses TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel.
Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.
COO-
COO-
COO-
+H3N
H
C
+H3N
H
C
+H3N
H
C
CH2
CH2
CH2
C
CH
N
Fenüülalaniin
H
OH
Trüptofaan
Türosiin
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõtsin kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ( = absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon on tingitus kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonia mg/ml või µmol/ml. Kasutasin olemasolevat kaliibrimissirget A versus CTyr leidsin absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsiooni kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.

Töö käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine

Minu uuritav preparaat oli alkanaas. Valmistasin uuritavast preparaadist ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml.Valmistasin 5 ml töölahust. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel 7,5 mg ehk 0, 0075 g alkanaasi ja lahustasin selle klaaspulga abil boraatpuhvris, mille pH=8,4.

Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine

Võtsin 50 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 ºC juurde 10 minutiks

Võtsin 4 kuiva katseklaasi normaalmõõdus ja nummereerisin need. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust.

Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi alustasin, kui kaseiini lahus oli 30 ºC-ni soojenenud. Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin läbi ja käivitasin stopperi .

Võtsin kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ja viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutasin. Seejärel asetasin hüdrolüüsisegu vesitermostaati tagasi.

Täpselt 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi, loksutaisn. Sama protseduuri kordasin veel 5 – minutiliste intervallidega 2 korda ehk uuesti 10-ndal ja 15-ndal minutil.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Proovidega katseklaasid jätsin täielikuks sademe moodustamiseks 15 minutiks seisma. Sel ajal panin valmis 4 puhast katseklaasi ning väikesed plastlehtrid ja paberfiltrid.
Proovid, milles sade oli põhja settinud, filtrisin kuivadesse katseklaasidesse. Kuna saadud filtraadid pidid olema täiesti selged, kordasin filtrimist kahe katseklaasiga.
Seejärel määrasin spektrofotomeetril nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse lainepikkusel λ= 280 nm, kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.

Spektrofotomeetri näidud:

Lahus: 0,388

Lahus: 0,530

Lahus: 0,670

Lahus: 0,883
Kaliibrimisgraafikult leidsin vastavalt proovide optilisele tihedusele neis sisalduva türosiini kontsentratsioon.
C1 = 0,0601 mg/ml t1 = 0 s
C2 = 0,0804 mg/ml t2 = 5 min = 300 s
C3 = 0,1066 mg/ml t3 = 10 min = 600 s
C4 = 0,1308 mg/ml t4 = 15 min = 900 s
Saadud katseandmete alusel koostasin graafiku, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t).
Graafikult on näha, et türosiini kontsertatsioon kasvab ajas. Sirge ei läbi y-telje nullpunkti, sest kaseiin sisaldab TKÄ-ga mittesadenevaid kompenente, mistõttu on türosiini vähesel määral ka 0-proovis.
Graafiku järgi on sellele ajavahemikule vastav kontsentratsiooni muut ∆C = 0,1308–0,0601 = 0,0707 mg/ml.
∆C – türosiini kontsentratsiooni muut = 0,0707
∆t – hüdrolüüsi kestus sekundites – 900 s
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht ml – 25 ml kaseiini + 1 ml ensüümipreparaati = 26 ml
2 – TKÄ lahusest tingitud lahjendus
V2 – ensüümilahuse üldmaht ml – 5 ml
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus ml – 1 ml
g – proteaasi kaalutis grammides - g = 0,0075
181 – türosiini molekulmass
μkat /g
Kokkuvõte:
Alkanaasi aktiivsuseks sain 15,05 μkat /g.

.DOCX Laadi alla originaalfail 5 lk · .docx · 8 allalaadimist

5 punkti Autor soovib selle materjali allalaadimise eest saada 5 punkti.

~ 5 lehte Lehekülgede arv dokumendis

2013-05-01 Kuupäev, millal dokument üles laeti

8 laadimist Kokku alla laetud

0 arvamust Teiste kasutajate poolt lisatud kommentaarid

olentark Õppematerjali autor

kaseiin proteaas kontsentratsioon katseklaasi reaktsioonisegu peptiidid aminohappeid peptiide aromaatset tuuma

Sarnased õppematerjalid

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Tallinna Tehnikaülikool Biokeemia Laboratoorne töö 3.2 Teostaja: 2016 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid, on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke.

Biokeemia

docx

Proteaasi aktiivsuse määramine

1. Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide või vabu aminohappeid. Proteaasid on väga levinud kõikides organismides, kuna nad osalevad paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises. Proteolüütilistel ensüümidel on erinevad toimespetsiifikad, osad lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid, teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele. Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin ja pepsiin, praktiliselt kõiki peptiidsidemeid valkudes lagundavad subtilisiin, savinaas ja alkalaas ning produtseerivad sellega ka vabu aminohappeid. Eristatakse endo- ja eksopeptidaase vastavalt sellele, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, ne

Keemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL Keemia instituut Bioorgaanilise keemia õppetool Biokeemia praktikumi laboratoorne töö 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Üliõpilane: Liis Hendrikson Matrikli nr: 104191 Õpperühm: KATB 41 Juhendaja: Tiina Randla 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Töö teoreetilised alused: Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (ka proteinaasid või peptidaasid) on ensüümis,

Biokeemia

docx

3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine - Biokeemia labori protokoll

Tallinna Tehnikaülikool 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Biokeemia labori protokoll 2011 Töö teoreetilised alused Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Seejuures nad produtseerivad madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase on kõikides organismides, sest nad täidavad füsioloogilisi funktsioone, sealhulgas katalüüsides toiduvalkude seedimist ja kõrgeltreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaade.

Biokeemia

pdf

3.2 Proteaas

Tallinna Tehnikaülikool YKL0060 Biokeemia Töö nr 3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Yasb 21 Juhendaja Tiina Randla 20.04.2012 Teooria Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, sest nende ülesanded ulatuvad alates toiduvalkude seedimisest kuni väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadideni nt vere

rekursiooni- ja keerukusteooria

docx

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

3.2. Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4) on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassida peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1 = Lys, Arg; R2 Pro) · Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Lei, Ile, Val; R2 Pro) · Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro). Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpept

Biokeemia

docx

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine

Biokeemia praktikum Laboratoorne töö nr.3.2 Anna Logunova YAGB-22 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides ,produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid: · Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro) · Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 Pro) · Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Samas aga palju

Biokeemia

docx

TTÜ Biokeemia praktikum: Proteaas

TÖÖ 3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE Juhendajad: Kaia Kukk Priit Eek Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke. Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide. Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu amino

Biokeemia

Rohkem sarnaseid