Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Õppeaine YKL0063
Biokeemia
PRAKTIKUM :
Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Üliõpilane: Juhendaja : 
Kood:
Esitatud:
Sooritatud :
3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE
Teooria
Proteolüütilised ensüümid e. proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega
Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid:
Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 ≠ Pro)
Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 ≠ Pro)
Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 ≠ Pro)
Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0).
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.
Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust , tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või μmol /ml (1 μmol = 181μg = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.
Töö käik

• Puhvri valmistamine:
  

Kaalusin 0,12 g boorhapet lisades dest vett kuni 10 ml. Kaalusin 0,19 g booraksit lisades vett kuni 10 ml. Väikese keeduklaasi pipeteerisin 5,5 ml boorhappe lahust ja 4,5 ml booraksi lahust. Kontrollisin lahuse pH ja sain 8,6, mis vastab nõutele.

• Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine:
  

Töölahuse kontsentratsioon peaks olema 2 mg/ml ja töölahuse kogus 5 ml. Sellest ma sain teada, et tahket ainet on 10 mg. Siis segasin 10 mg savinaasi 5 ml veega.

• Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine:
  

Pipeteerisiin tuubi 12 ml 2% - list kaseiini lahust ja panin termostaati 30oC juurde. Nummerdasin 4 kuiva 15 ml tuubi ja pipeteerisin sinna 1 ml 5% - list TKÄ lahust.
Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 0,5 ml valmistatud proteaasi töölahust, reaktsioonisegu loksutasin kiiresti läbi ja võtsin nullproovi. Peale ensüümi lisamist võtsin puhta pipetiga võimalikult kiiresti 2 ml reaktsioonisegu, viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse tuubi (0- proov ) ja tuubi sisu loksutades hoolega. Peale proovi võtmist panin reaktsiooniseguga tuub kiiresti tagasi termostaati. Täpselt 5, 10 ja 15 minuti pärast võtsin sama pipetiga 2 ml reaktsioonisegu teise tuubi ja loksutasin.

• Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
  

Proovidega tuubid jätsin sademe formeerumiseks 10–15 minutiks seisma. Edasi proovid panin tsentrifuugisse ja pärast seda filtreerisin neid. Sain selgeid lahuseid ja määrasin nende optilist tihedust spekrofotomeetriga lainepikkusel  = 280 nm (D280). Kaliibrimisgraafikult leidsin vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsioon (mg/ml või μmol/ml). Saadud katseandmete alusel koostatan graafik , mis väljendab türosiini kontsentratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t) ja arvutan ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus, mis A vastab valemile:
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml),
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s),
V1 – reaktsioonisegu ( substraat + ensüüm) üldmaht (ml),
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml),
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (1 ml  2 ml, seega L = 2),
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml),
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g),
181 – türosiini molekulmass.
Tulemus
Aeg
(sek)
Optiline tihedus
(A)
Türosiini kontsentratsioon (mg/ml)
0
0,3040
0,047
300
0,4282
0,067
600
0,4952
0,079
900
0,6353
0,10
Järeldus:
Savinaasi proteolüütiline aktiivsus on 7,83 μkat/g.
Türosiini kontsentratsioon ja aeg on seotud lineaarse sõltuvusega, siis katsetulemused pidid graafikul langema ühele sirgele. Koostatud graafikul kõik katsepunktid peaaegu langesid ühele sirgele. Ebatäpsus võis tulla sellest, et võetud proovid ei olnud täpselt 5 minutilise vahega ning seetõttu ei saanud ka graafik lineaarne tulla.