Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (0)

Tallinna Tehnikaülikool
3.2 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Liina Reimann
134537KATB
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid , mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Proteaase leidub kõikides organismides, nad seedivad näiteks toiduvalke.
Mõned proteolüütilised ensüümid lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs). Piiratud proteolüüsi viivad läbi näiteks trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, mis produtseerivad enamasti peptiide.
Subtilisiin, savinaas ja alkalaas on bakteriaalsed proteaasid, mis lagundavad praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid.
Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo - ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud on endopeptidaasid.
Ensüümi toimimise optimaalse keskkonna järgi eristatakse hapusid (pH ~2,5), neutraalseid (pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0).
Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin -, tiool-, aspartaat - ja metalloproteinaasideks.
Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise . Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete ( türosiin , trüptofaan, fenüülalaniin ) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.

Töö käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
• Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi .
• Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 17,9 mg ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) gradueeritud katseklaasi
Ensüümireaktsiooni läbiviimine
• Võetakse 50 ml katseklaas , kuhu pipeteeritakse 25 ml 2% kaseiini lahust pH 8,4 juures
• Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 kraadi juurde 10 minutiks
• Võetakse 4 kuiva 20 ml katseklaasi ja nummerdadakse
• Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5% TKÄ lahust
• 10 min möödudes pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi lahust, reaktsioonisegu loksutatakse ja asetatakse termostaati tagasi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg
• Peale proteaasi lisamist võetakse kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ning viiakse see esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutatakse
• Toimingut korratakse 5, 10 ja 15 minuti möödudes reaktsiooni algusest
Reaktisooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine
• Proovidega katseklaasid jäetakse 15 minutiks sademe formuleerumiseks seisma
• Proovidega katseklaaside sisud filtreeritakse kuivadesse katseklaasidesse
• Kontrollitakse, et filtraadid on täiesti selged
• Proovide optilised tihedused määratakse spektrofotomeetril lainepikkusel 280 nm kasutades kvartsküvette
• Vastavalt saadud väärtustele leitakse kaliibrimissirgelt türosiini kontsentratsioonid
• Koostatakse graafik , mis väljendab türosiini kontsentratsiooni sõltuvust ajast
• Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv valitud ajavahemikus
• Arvutatakse ensüümipreparaadi aktiivsus
Katse tulemused
Aeg
Optiline tihedus λ=280nm
Türosiini konsentratsioon
0- proov
15 sek
0,3796 Abs
0,06 mg/ml
1- proov
304 sek
0,6284 Abs
0,10 mg/ml
2-proov
615 sek
0,8903 Abs
0,141 mg/ml
3-proov
904 sek
1,0232 Abs
0,194 mg/ml
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus ΔCTyr= 0,134 mg/ml
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s), Δt = 904 sek
V1 – reaktsioonisegu ( substraat + ensüüm ) üldmaht (ml), V1 = 26 ml
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml), V2 = 5 ml
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2),
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml), V3 = 1 ml
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g), g = 17,9 mg=0,0179g
Järeldus
Alkalaasi proteolüütiline aktiivsus on 11,89 , mis tähendab, et 30 kraadi juures 1 sekundi jooksul vabastab ensüüm 11,89
aminohapet. Katse ebatäpsus võis tuleneda ebatäpse aja mõõtmisest või ensüümi ülekandmisel mõõteklaasist katseklaasi.