PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (0)

Tallinna Tehnikaülikool
TTÜ keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö 3.2
PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk
Tallinn 2013

Sisukord

Sissejuhatus 3
Teoreetiline osa 3
Töö käik 4
Katse andmed 5
Arvutused 6
Järeldus 7

Sissejuhatus

Laboratoorse töö 3.2 teemaks oli proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine.
Töö käigus valmistati töölahus, viidi läbi kaseiini hüdrolüüs (vajasime hüdrolüüsi produkte) ja mõõdeti seejärel reaktsiooniproduktide sisaldust spektrofotomeetril.
Katses oli ensüümina kasutusel alkalaas .

Teoreetiline osa

Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid . Nad osalevad näiteks toiduvalkude seedimises ja vere hüübimise kaskaadis.
Eristatakse endo - ja eksopeptidaase. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase.
Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide ehk aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini (piima põhivalk) hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trokloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja. Lahusesse jäävad pärast filtreerimist vabad aminohapped ja madalamolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Trp, Phe) on nähtavad spektrofotomeetriliselt lainepikkustel 270-280 nm.

Töö käik

Kõigepealt valmistatakse ensüümipreparaadist töölahus. 5 ml töölahuse saamiseks pidin kaaluma 10 mg alkalaasi preparaati. Kaalumisel sain aga 12,0 mg ning pärast õppejõuga konsulteerimist otsustasin selle kaalutis edasi töötada. Uue kaalu korral oli vaja võtta puhverlahust (boraatpuhver, pH=8,4) 6 ml. Paraku valasin seda graduleeritud katseklaasi liiga palju ning sain 10 ml lahust. Järjekordsel konsulteerimisel õppejõuga otsustasin jätkata väiksema kontsentratsiooniga lahusega.
Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml.
Edasi tehakse ettevalmistusi ensüümireaktsiooniks. 50 ml katseklaasi pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiini lahust ( substraat ). Katseklaasile pannakse peale kork ning asetatakse see vesitermostaati 5‑10 minutiks soojenema. Samal ajal võetakse 4 kuiva katseklaasi, nummerdatakse need ning pipeteeritakse igaühte 3 ml 5%-list TKÄ lahust.
Kui kaseiini lahus on soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni – kaseiini hüdrolüüsi. Kaseiinile pipeteeritakse juurde 1 ml valmistatud alkalaasi töölahust. Reaktsioonisegu loksutatakse läbi. Fikseeritakse reaktsiooni alguse kellaaeg .
Võimalikult kiirelt pipeteeritakse kuiva puhta pipetiga 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Katseklaasi loksutatakse hoolega. Suurem katseklaas reaktsiooniseguga asetatakse kiirelt tagasi vesitermostaati.
Täpselt viie minuti pärast võetakse uuesti sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ja pipeteeritakse see teise katseklaasi. Reaktsioonisegu asetatakse tagasi termostaati. Teise katseklaasi sisu loksutatakse. Sama tehakse ka katse 10-ndal ja 15-ndal minutil.
4 proovidega katseklaasi jäetakse täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma. Samal ajal võetakse 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning asetatakse neile lehtrid ja filterpaberid. Kõik proovid filtreeritakse, et saada selged lahused . Minu lahuseid ei olnud vaja teist korda filtreerida – tulemus oli pärast esimest filtreerimist sobiv. Edasi määratakse kõigi nelja proovi optilise tiheduse väärtused spektrofotomeetri abil.

Katse andmed

D280;1=0,150
D280;2=0,154
D280;3=0,219
D280;4=0,269
CTyr;1=0,024 M
CTyr;2=0,025 M
CTyr;3=0,034 M
CTyr;4=0,043 M
Esimeses katseklaasis saadud tulemus ei saanud õige olla. Nimelt oleks pidanud kõigi nelja proovi optiliste tiheduste vahe olema (enam-vähem) võrdne. Esimese katseklaasi viga võis seisneda selles, et pärast reaktsioonisegu valmimist ei segatud seda piisavalt.
Graafiku tegemisel kasutan kolme järgmist tulemust:

Arvutused

Valem:
ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml)
Δt – hüdrolüüsi kestus (s)
V1 – reaktsioonisegu üldmaht (26 ml)
V2 –