Valkude detekteerimiseks(=kindlakstegemiseks) kasutatakse: värvusreaktsioonid, väljasadestamine, väljasoolastamine. Kvalitatiivsed reaktsioonid: universaalsed (üldreaktsioonid) ja spetsiifilised (erireaktsioonid). BIUREEDIREAKTSIOON Kasutatakse et määrata ühendit millel on kaks või enam peptiidsidet aluselises keskonnas Cu2+-ioonidega moodustavad violetse kompleksi. Valkude üldreaktsioon. 1.1ml munavalgu 2.1ml 10%-list NaOH, 1 tilk 1%-list CuSO4 3.Loksutasin Lahus muutus sinakasvioletseks => Cu2+-ioonid moodustusid valgumolekulidega biureetkompleksi => lahuses olid valgud. KSANTOPROTEIINREAKTSIOON (MULDERI REAKTSIOON) Kasutatakse et määrata aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu. Konts. lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub, soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine (kollane). 1.1ml munavalgu 2.6 tilka konts. HNO3 3.Loksutasin ja soojendasin 4
1 Eda Türi 142281 YAGB21 Reaktsioonivõrrandist pilt biokeemia laboratoorsete tööde juhendist Töö käik Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. Lisasin sama palju 10%-list NaOH lahust ning 4 tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin ning soojendasin katseklaasi vesivannil. Tulemus Lahus muutus esialgu helelillaks. Pärast soojendamist muutus lahus pruuniks. Järeldus Lahuses esinesid valgumolekulid (ühend, mis sisaldab kahte või enamat peptiidsidet), sest moodustus violetne biureetkompleks. 1.1.2.Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Teoreetilised alused Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus.
1. Biureedireaktsioon Biureedireaktsioon on valkude üldreaktsioon, kuna kaht või enamat peptiidsidet sisaldavad ühendid moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. Lühikese ahelaga peptiididega (valgu hürdolüüsi produktidega) moodustavad Cu2+-ioonid roosa värvusega biureetkompleksi. Töö käik: valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja ühe tilga 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin katseklaasi sisu. Reaktsioonisegu muutus lillaks. Järeldus: lahuses olid peptiidsidemed, kuna need moodustasid aluselises keskkonnas Cu 2+-ioonidega violetse biureetkompleksi. 2. Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Mulderi reaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) sisaldumist valgus. Konsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja seadestub. Katseklaasi
Tulenevalt peptiidsidemete esinemisest, on tegemist valkude üldreaktsiooniga. Cu2+-ioonid ühinedes valgumolekulide nelja peptiidsideme koostisesse kuuluvate lämmastiku aatomitega moodustavad sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiidide korral roosa biureetkompleksi. Töö käik: 1) Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. 2) Lisasin lahusele 1 ml 10%-list NaOH lahust leeliselise keskonna tekkeks ja tilga 1%-list CuSO4 lahust Cu2+-ioonide saamiseks. Loksutasin. 3) Reaktsiooni kiirendamiseks soojendasin katseklaasi vesivannil. 4) Lahuse sinakas värvus muutus lillaks ning põhja kogunes sinine sade . Tulemused: Lahuse kuumutamisel tekkinud lillakas värvus viitab positiivsele reaktsioonile, mis tähendab, et Cu2+-ioonid liitusid munavalgu peptiidsidemete koostisse kuuluvate lämmastiku aatomitega. Põhja kogunenud sinise sademe põhjal võin järeldada, et lahuses polnud piisavalt Cu2+-ioone, millega munavalk oleks võinud reageerida
peptiidsidet, annavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. Aluselises keskkonnas annavad Cu(II)-ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüsi produktidega) roosaka värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja Cu2+-ioonide hulgast lahuses. Katse käik: Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. Lisasin sama palju 10%-list NaOH lahust ning paar tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin ning soojendasin katseklaasi. Tulemus: Lahus värvus violetseks. Järeldused: Lahuses esinesid valgumolekulid (ühend, mis sisaldab kaht või enamat peptiidsidet), sest moodustub violetne biureetkompleks. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Mulderi reaktsiooniga saab tõestada aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus. Kontsentreeritud HNO3 lisamisel valk denatureerub pöördumatult ja sadestub lahusest välja. Soojendamisel aromaatsed tuumad nitreeruvad
mistõttu lühikesed peptiidahelad, olles vaseioonidega kokkupuutes, andsid uue värvuse- musta-kollaka. Biureet- Uurea Cu2+ (liias) kompleks 1.1.2. Ksantoproteiinreaktsioon ( Mulderi reaktsioon) ~1 ml munavalgu lahusele lisasin 6 tilka kontsentreeritud HNO3. Selle tulemusena tekkis valge sade. Loksutasin ja panin katseklaasi kuuma vee sisse- lahus muutus koheselt üleni valgeks. 3 min soojendades sain tulemuseks kollase paksu massi. Järeldus Kontsentreeritud lämmastikhappe juuresolekul denatureerus valk pöördumatult ja sadestus. Soojendamisel toimus aromaatsete tuumade nitreerumine- moodustus kollase värvusega nitrofenooli ühend. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend käitub alus/hape indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse.
Antud tingimustele vastavad ühendid värvuvad Cu2+ ioonidega kompleksi moodustades violetseks. See on valkude üldreaktsioon. Cu2+ ioonid seostuvad peptiidsidemesse kuuluvate nelja lämmastiku aatomiga ning sellest on tingitud reaktsioonis toimuv värvi muutus. Värvi intensiivuss sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik: Katseklaasi valasin u. 1ml munavalgu lahust, lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja 2 tilka 1%- list CuSO4 lahust. Loksutasin katseklaasi sisu. Värvuse muutus toimus suhteliselt kiiresti ning vesivannil soojendamist ei vajanud. Järeldus: Sellest katsest saab järeldada, et munavalgu lahus on valgu lahus, ehk sisaldab kaht või enamat peptiidsidet. 1.1.2 Ksantoproteiinireaktsioon (Mulderi reaktsioon) Selle katsega saab määrata aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus (Tyr, Phe, Trp). Valk denatureerub pöördumatult ja sadestub kui lisada sellele konts. Lämmastikhapet
sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega roosa värvusega biureedikompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsideme koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik: · valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust · lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõne tilga 1%-list CuSO4 lahust · loksutasin hoolikalt Tulemused ja järeldused: Lahus muutus lillaks või violetseks, millest võib järeldada, et lahuses oli aluseline keskkond ning tekkis biureedikompleks. See omakorda tõestab 2 või enama peptiidsideme olemasolu lahuses. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Ksantoproteiinreaktsioon tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lämmastikhappe lisamisel denatureerub valk pöördumatult ja sadestub
Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 2,5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 7,5 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin. Pipeteerisin esimest lahjendust 5 ml teise katseklaasi, kus oli juba 5ml destilleeritud vett ning loksutasin, nii sain 0,125 mg/ml lahjenduse
allub hõlpsasti leeliselise hüdrolüüsile, ja annab sulfiidioone. Pb2+ - ioonide juuresolekul need moodustavad tumepruuni PbS sademe. Katse teostatakse Pb(CH3COO)2 , milline moodustab alulises keskonnas Na2S. Na2S annab valgust vabanenud PbS-ga. Töö käik: 1 2 ml 0,5%-lisele lahusele lisasin ettevaatlikult tilgakaupa 10%-list lahust. Katseklaasis tekkis sade. Seda oli näha sellest, et lahus muutus häguseks. 2 Lisasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. 3 Loksutasin reaktsioonisegu. 4 Soojendasin reaktsioonisegu mõne minuti vältel, kuni algas pruunikasmusta kolloidse sademe moodustumine. Kuumutades muutus lahus pruuniks, lahus ise oli selge. 5 Asetasin katseklaasi statiivi. Tekkis sade.. Järeldus Kuumutamisel lahus muutus pruuniseks pärast muutus tumepruuniseks. PbS aeglaselt välja sadeneb ja see tähendab, et munavalgus esineb Cys aminohappe. 1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega.
saadud lahust elektripliidil. c) Kolmandasse katseklaasi lisain ~1 mL BaCl2 lahust. 2. Valasin kahte katseklaasi ~2 mL K3[Fe(CN)6] lahust. a) Ühte katseklaasi lisasin mõned tilgad NH4SCN lahust. b) Teise katseklaasi lisasin Cd2+ ioone sisaldavat lahust (Cd(CH3COO)2). Ammiinkompleksid. Saamine ja omadused 1. Valasin nelja katseklaasi ~3 mL 0,25 M CuSO4 lahust. a) Esimesse katseklaasi lisain 7 tilka 0,5 M NH 3H2O vesilahust, loksutasin ja seejärel lisain veel 15 tilka 6 M NH3H2O vesilahust, et Cu(OH)2 sade lahustuks. b) Teise katseklaasi lisasin 5 tilka 0,2 M NaOH lahust ja loksutasin saadud lahust. c) Kolmandasse katseklaasi lisasin 5 tilka 0,5 M NH4Cl lahust. d) Neljandasse katseklaasi panin ühe Zn graanuli. 2. Eelneva katse käigus saadud vase ammiinkompleksi sisaldava lahuse jagasin võrdselt kahte katseklaasi.
11. Sain glükoosi standardlahusest kolm lahjendust kontsentratsioonidega: a) 0,25 mg/ml b) 0,125 mg/ml c) 0,062 mg/ml 12. Panen statiivi 6 kuiva ja puhast katseklaasi. Tähistasin need: 1, 2a, 2b, 3, 4, 5 NULLPROOV näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni Katseklaas Sooritatud tegevus KATSEKLAAS 1 (NULLPROOV!) Pipeteerisin 1 ml destileeritud vett + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks KATSEKLAAS 2a (PARALLEELPROOV!) Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks KATSEKLAAS 2b (PARALLEELPROOV!) Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+- ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. 3 Töö käik Valasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. Lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ning mõned tilgad 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin ning soojendasin vesivannil. Reaktsioonisegu värvus muutub sinisest alguses lillaks ning hakkab siis muutuma pruunikas-tumelillamaks. Värvus on tingitud valgumolekulide ja Cu2+ poolt moodustunud kompleksist, seega sisaldab munavalgu lahus (vähemalt) kahte peptiidsidet. 1.2. Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Teoreetilised alused Ksantoproteiinreaktsioon (xanthos kollane, kr k) tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus
Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Minu uuritavaks lahuseks oli mesi, mida ma kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,1199 g ning viisin selle kvantitatiivselt 200 ml mahuga mõõtekolbi. Selleks kuumutasin destilleeritud vett ning lisasin väikeses koguses vett kaaluklaasi, segasin lahust klaaspuga ning valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtkolbi. Seda kordasin veel 3 korda. Järgnevalt täitsin mõõtkolvi mahus destilleeritud veega ning loksutasin lahust kontsentratsioonide ühtlustumiseks. Ootasin kuni lahus oli jahtunud ning lisasin destilleeritud vett kuni kriipsuni. Lahuse pH väärtust ei pidanud mõõtma. Glükoosilahuste valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb esmalt koostada kalibreerimisgraafik lainepikkusel = 410 nm. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoos 1,0 mg/ml. Selleks valmistasin standardlahusest kolm lahjemat
Seda tegin kuuma destilleeritud veega, mida lisasin väikeste portsionitena 3 korda kaaluklaasi, segasin klaasi sisu väikese metallpulgaga ja valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtekolbi. Ca 2/3 kolvi mahust täitsin kuuma destilleeritud veega ja hoidsin kolbi veel ~20 minutit kuumas vesivannis. Seejärel jahutasin lahuse toatemperatuurini ning täitsin kolbi külma destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, sulesin korgiga ja ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks loksutasin läbi. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtusin glükoosi standardlahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust. Selleks kasutasin samm-sammult lahjendamist: Nagu skeemilt näha, toimisin järgnevalt: võtsin 2,5 ml standardlahust ning lisasin 7,5 ml destilleeritud vett ja loksutasin hoolikalt läbi
· K3[Fe(CN)6] (K-heksatsüanoferraat(II)) 0,1% lahus, mis täidab kolvi märgini. Uuritava proovi (mee lahus) ettevalmistamine: 1. Kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,11 g mett. 2. Viisin meeproovi kvantitatiivselt (kadudeta) 200 ml mõõtekolbi (et ei peaks rohkem lahjendama). Selleks kasutasin kuuma dest. vett. Loputasin kaaluklaasi 3 korda. 3. Täitsin 2/3 kolvi mahust kuuma dest veega ja hoidsin kolbi 15 minutit kuumas vesivannis, loksutasin aeg-ajalt. 4. Kontrollisin lahuse pH väärtust universaalindikaatorpaberiga, ei olnud vaja lahust neutraliseerida. 5. Täitsin kolvi märgini külma dest. veega, sulgesin korgiga ja loksutasin. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: 1. Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 2. Alglahuses ja lahjenduses sisaldub üks ja sama ainehulk: Cst * Vst = Clahj * Vlahj. 3
roosa värvusega buiretkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses. Töö käik Valasin katseklaasi ~1 ml munavalgu lahust ja lisasin sama kogustl 10%-list NaOH lahust ja 4 tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin hoolikalt. Töö tulemus Lahuse värvus muutus lillaks, mis tähendab, et vase ioonide kordinatiivne seostumine 4 lämmastikkudele peptiidsidemete koostises. Saame teha järeldusi, et lahuses meil oli valk. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Ksantoproteiinreaktsioon toestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lammastikhappe lisamisel denatureerib valk poordumatult ja sadestub
See annab valgust vabanenud sulfiidioonidega , mis aeglaselt välja sadeneb. Töö käik: · 2 ml 0,5%-lisele lahusele lisasin ettevaatlikult tilgakaupa 10%-list lahust. Katseklaasi tekkis sade (seda oli näha sellest, et lahus muutus hetkeks hägusaks), mis lisamisel kadus. Esimese tilga lisamisel tekkis lahusesse valge sade, millest andis tunnistust hägusaks muutunud lahus. juurdelisamisel sade kadus. · Lisasin katseklaasi 1 ml munavalgu lahust. · Loksutasin reaktsioonisegu. · Soojendasin reaktsioonisegu mõne minuti vältel, kuni algas pruunikasmusta kolloidse sademe moodustumine. Kuumutades muutus lahus pruuniks, lahus ise oli selge. · Asetasin katseklaasi statiivi. Jättes katseklaasi statiivile seisma, sadet siiski ei tekkinud. Järeldus Lahus muutus küll tumepruuniks, mis annab tunnistust tsüsteiini esinemisest valgus, kuid sadet ei tekkinud
Järgnevalt lisasin uuritavale ainele boraatpuhvrit (pH=8,4), esialgu väiksema koguse. · Järgnevalt segasin gradueeritud katseklaasi segu 5 minuti vältel, et ensüüm lahustuks. Selgelt lahust seejuures ei tekkinud, sest uurisin tehnilist ensüümipreparaati, mis lisaks ensüümivalkudele sisaldab ka muid valke ja täiteaineid. · Hiljem viisin katseklaasis oleva lahuse sobiva mahuni, milleks oli 5 mL ja lisasin katseklaasile korgi ja loksutasin seda, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 mL lahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin pipetiga 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Asetasin katseklaasile korgi ja asetasin eelnevalt soojendama pandud vesitermostaati 30°C juurde 10ks minutiks soojenema.
Töö käik Tugevate ja nõrkade elektrolüütide keemiline aktiivsus Ühte katseklaasi valasin 2 mL 2 M soolhapet ja teise samapalju 2 M etaanhapet. Viisin mõlemasse katseklaasi tsingitükid ning asetasin katseklaasid kuuma vette. Tasakaal nõrga happe ja nõrga aluse lahuses Valasin katseklaasi 4 mL vett ja lisasin 3 tilka 2 M etaanhapet ja 2 tilka metüülpunast. Jagasin saadud lahuse kaheks. Ühele osale lisasin tahket naatriumetanaati, loksutasin ja võrdlesin lahuste värvusi. Valasin katseklaasi 4 mL vett ja lisasin sellele 3 tilka 2 M ammoniaagi vesilahust ja 2 tilka fenoolftaleiini. Jagasin lahuse kaheks. Ühele osale lisasin tahket ammooniumkloriidi, loksutasin ja võrdlesin lahuste värvusi. Soolhappe kontroll-lahuse täpse kontsentratsiooni määramine tiitrimisega Pipeteerisin 250 mL koonilisse kolbi 10 mL õppejõult saadud HCl kontroll-lahust (lahus nr 10) ja lisasin 2 tilka fenoolftaleiini lahust.
üldreaktsioonid- omased kõikidele valkudele, spetsiifiised ehk erireaktsioonid- iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele. 1.1.1 Biureedireaktsioon Üldreaktsioon, kuna on tingitud peptiidsidemete esinemisest. Aluselises keskkonnas moodustavad valgumolekulid Cu2+ ioonidega olenevalt ahela pikkusest kas sinakasvioletse või roosaka biureetkompleksi. Töö käik: valasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust, lisasin 1ml 10% NaOH ning paar tilka CuSO4 lahust, loksutasin. Värvus muutus lillakaks, sest vaseioonid moodustasid valgumolekulidega biureetkompleksi. 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Tõestab aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Konts. HNO3 lisamisel denatureerub valk lõplikult ja sadestub. Lahuse kuumutamisel toimub aromaatse tuuma nitreerumine ning lahus muutub kollaseks. Moodustunud ühend käitub indikaatorina, moodustades leeliselises keskkonnas oranzi värvuse.
1.1.1. Biureedireaktsioon Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+ -ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Töö käik Katseklaasi valasin 1 ml munavalgu lahust. Lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutasin hoolikalt. Tulemus CuSO4 lisamisel lahus muutus violetseks. Järeldus Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+ -ioonidega violetse kompleksi. Tulemus tunnistab biureedikompleksi tekkimisest lahusesse. Kas meie lahuses on pigem valgud või peptiidid ja kas nende kontsentratsioon on kõrge või madal? (Tekkinud värvuse ja selle intensiivsuse põhjal)
Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestatakse TKÄ-ga, mis ühtlasi peatab ka ensüümi. Seejärel määratakse mitte sadestuvad hüdrolüüsi produktid spektrofotomeetriga. Töö käik 1. Valmistasin uuritava proteaasi Savinase lahuse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Kaalusin analüütilistel kaaludel ensüümi 0,006 g. Viisin selle kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Lisasin väikse koguse puhvelahust ja loksutasin, kuni ensüüm lahustus. Seejärel lisasin puhverlahust juurde, nii, et seda oli kokku 5ml. 2. Võtsin 50ml mahuga suurema katseklaasi ja pipteerisin sinna 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin vesitermostaati 30 C ° juurde 10 minutiks seisma. 3. Võtsin neli katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipteerisin igaühte 3ml 5%-list TKÄ lahust. 4. Kui kaseiini lahus oli soojenenud, alustasin hüdrolüüsi. Pipteerisin kaseiinile
Selleks kaalusin 0,0049 grammi tahket ensüümipreparaati (Alcolase) ja lahustasin selle boraatpuhvris 5 ml-ni (pH=8,4). Järgnevalt pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin lahuse kümneks minutiks vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Samal ajal kui lahus soojenes, pipeteerisin nelja kuiva katseklaasi, igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, lisasin sellele 1 ml uuritavat proteaasi lahust, loksutasin ning võtsin kohe kuiva pipetiga 3 ml seda hüdrolüüsisegu ja viisin esimesse katseklaasi, kus oli TKÄ lahus ja loksutasin hoolega. Kohe oli näha valkja sademe moodustumist. Viis minutit pärast seda toimingut võtsin uuesti 3 ml seda hüdrolüüsisegu, mille viisin teise katseklaasi, kus oli TKÄ lahus, loksutasin. Sama toimingut kordasin 5-minutiliste intervallidega ka kolmanda ja neljanda katseklaasiga.
Uuritavast proteaasi preparaadist, milleks antud töös oli savinaas, valmistati ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, mille kontsentratsioon oli 1,5 mg/ml. Arvutasin savinaasi kaalutise suuruse, milleks oli 0,0075 grammi. Kaalusin analüütilistel kaaludel antud koguse ning tegin lahuse gradueeritud 5 milliliitrise mahuga katseklaasi. Esialgu lisasin väikese koguse puhverlahust ning segasin seda ~5 minutit kuni lahustumiseni, seejärel täitsin katseklaasi etteantud mahuni ning loksutasin, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümreaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · pipeteerisin suurde 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ning asetasin selle korgiga kaetuna vesitermostaati 5-10 minutiks seisma · võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi, nummerdasin need ning igaühte lisasin 3 ml 5%-list TKÄ lahust · kui kaseiini lahus oli piisavalt soojenenud, alustasin ensüümireaktsooni, selleks
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamine Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard- lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt . · Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust järgmiselt. kontsentratsiooniga standardlahust pipeteerisin sobiva suurusega katseklaasi 2,5 ml, millele pipeteerisin 7,5 ml destilleeritud vett. Katseklaasi sulgesin korgiga ning loksutasin glükoosilahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahjendatud glükoosilahust teise kuiva katseklaasi ning pipeteerisin sinna sama palju destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katselaasi korgiga ja loksutasin kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahust kolmandasse katseklaasi ning samuti 5 ml destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin segamini
3 on hüdroksüleeritud. Võimelised moodustada rasvhapetega estreid steriidid. Levinuim loomne sterool on kolesterool (tagab membraani läbitavus ja voolavus) millest toodetakse sapphappeid, steroidhormoone ning D-vitamiini. Töö käik ja tulemuste analüüs 1.3.1 Rasvaplekiproov 1. Võtsin kaks kuiva katseklaasi, millesse panin 1 g tahket uuritavat ainet 2. Mõlemasse katseklaasi lisasin 0,5 ml tetraklorometaani, loksutasin 3. Jäin tahke materjali settimiseks 5 minutit seista 4. Kui sademe kohale on tekkinud selge lahuse kiht, siis kandsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilk lahust filterpaberile ja jäin kuivada Mõlemad rasvaplekkid olid vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam, kuna lipiidid suurendavad paberi läbipaistvus => mõlemad uuritavad ainet sisaldasid lipiide 1.3.2 Emulsioonitest 1
ensüümipreparaati ja viisin kadudeta (kvantitatiivselt) lahuse valmistamiseks gradueeritud katseklaasi. Kaalutis = 0,0074 g · Lisasin väikese koguse puhverlahust ja segasin klaaspulgaga umbes 5 min kuni ensüüm on lahustunud. Ensüümipreparaat lahustus peaaegu täielikult, sest see sisaldas ka täiteainet, mis ei lahustunud. Seepärast tekkinud lahus ei olnud täielikult selge. · Seejärel täitsin klaasi puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutasin läbi, et ensüümi kontsentratsiooni lahuses ühtlustada. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 ml mahuga suur katsekaas, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. · Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati juurde umbes 5 10 minutiks soojenema. · Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin.
Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam. Oluline on meeles pidada, et järeldusi saab teha kuiva(tatud) proovidega paberit uurides, sest niiske paberi läbipaistvus on suurenenud ka lipiidide mittesisaldavate lahuste korral. Töö käik Võtsin kaks kuiva katseklaasi, kumbagi katseklaasi lisasin väikse tüki erinevat tahket ainet, mille lipiidset koostist oli vaja uurida. Lisasin 0,5ml orgaanilist lahustit mõlemasse katseklaasi, loksutasin ja lasin settida umbes 5 minutit. Mõlemast katseklaasist kandsin pipetiga tilga lahust kahele filterpaberile ja lasin kuivada. Kuivanud paberit vaatlesin vastu valgust. Filterpaberil,millel oli rasvaproov Nr 1, oli ,,rasvane paber". Seega rasvaproov nr 1 sisaldas lipiide. 1.3.2 Emulsioonitest Emulsioon on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud
Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam. Oluline on meeles pidada, et järeldusi saab teha kuiva(tatud) proovidega paberit uurides, sest niiske paberi läbipaistvus on suurenenud ka lipiide mittesisaldavate lahuste korral. Töö käik Võtsin kaks katseklaasi selleks, et uurida antud proove, kas on tegu lipiididega või mitte. Ühesse panin 1g proovi nr 1, teise 1g proovi nr.2 ja mõlemasse lisasin 0,5 g atsetooni. Loksutasin hoolikalt ning jätsin umbes 5 minutit seista, et tahke materjal settiks. Kui sademe kohal tekkis selge lahuse kiht, kantsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilk lahust filterpaberile ja lastsin kuivada. Kuiva paberit vaatasin vastu valgust ja märkasin, et paberil 1. prooviga on rasvaplekk, mis suurendab tema läbipaistvust. Saan järjeldada, et lipiide sisaldas 1. proov 1.3.2 Emulsioonitest Emulsiooniks nimetatakse kahest mittesegunevatest vedelikust koosnevat süsteemi. Kuna emulsioonid
mille pH oli eelnevalt reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Sulgesin katseklaasi korgiga ja panin vesitermostaati 30 C juurde u 10 minutiks soojenema. Võtsin 4 kuiva katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipeteerisin igasse katseklaasi 3 mL 5%-list TKÄ lahust. Pärast kaseiinilahuse soojenemist, alustasin ensüümireaktsiooni. Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 mL valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin ning võtsin puhta kuiva pipetiga kiiresti 3 mL reaktsioonisegu, mille viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, loksutasin. See oli 0-proov. Reaktsioonisegu asetasin termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ka reaktsiooni alguse aja stopperil. 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga jälle 3 mL reaktsioonisegu ja panin teise katseklaasi, loksutasin läbi. Reaktsioonisegu panin jälle tagasi termostaati. Samamoodi toimisin ka 10-ndal ja 15-ndal minutil
Lahuses olev hape neutraliseeritakse NaOH lahuse abil. Töö käik Mulle oli antud ,,Minu röst" mitmeviljasepik. Peenestasin antud sepikusisu ning kaalusin sellest 25g kahte 500 ml mõõtkolbi.Täitsin 250ml mõõtkolbi kriipsuni veega. Seejärel lisasin ligikaudu mõõtkolvi neljandiku ulatuses vett koonilisse kolbi, kus sees olid juba peenestatud sepiku tükid.. Segasin kuni tekkis ühtlane mass. Seejärel valasin kogu ülejäänud vee ning loksutasin 2 minutit. Jätsin seejärel seisma 10 minutiks, mille möödudes loksutasin jälle 2 minuti vältel. Pärast seda seisid proovid veel 8 minutit toatemperatuuril. Seejärel filtreerisin kolvide sisu ning pipeteerisin 50ml sellest 150 ml koonilisse kolbi(igast proovist 2 paralleelkatset). Pipeteeritud lahusele lisasin fenoolftaleiini ning tiitrisin 0,1 N NaOH lahusega, kuni tekkis kerge roosa värvus. Katsetulemused: Vvesi(vee kogus)-250 ml
ning D-vitamiini. Sama funktsiooni taimerakkudes täidab fütosterool. 1.3.1 Rasvapleki proov Lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel jääb paberile rasvaplekk. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam. Töökäik: Uurisin kahte tahket proovi. Võtsin kummastkist väikse koguse proovi ning panin nad eraldi kuiva katseklaasi. Mõlemasse katseklaasi lisasin 0,5 ml atsetooni. Loksutasin ja lasin proovil settida. Mõlemast katseklaasist võtsin pipetiga tilk lahust filterpaberile ja lasin kuivada. Kuiva paberit vaatasin vastu valgust ning varju suunas. Järeldus: Suurem plekk tekkis teise proovi materjalist kui esimesest. See tähendab, et teine proov sisaldas rohkem lipiide kui esimene. 1.3.2. Emulsioonitest Emusioonideks nimetatakse selliseid süsteeme, millised koosnevad kahest teineteises mitteahustuvast vedelikust, üks nendest on jaotatud teises väikesteks tilkadeks
Kõik lipiidid lahustuvad orgaanilistes lahustites. Kui lipiidi sisaldava lahuse tilk kanda paberile, siis lahusti aurustumisel moodustub moodustub paberile rasvaplekk, mille tõttu paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust alast paberil heledam ja pimeda ala poole vaadates tumedam. Katse käik: Panin ühte katseklaasi u 1g rasvapleki proovi ainet I ja teise katseklaasi sama palju rasvapleki proovi ainet II. Lisasin mõlemasse katseklaasi u 0,5 ml atsetooni. Loksutasin ja lasin settida. Sademe kohale tekkis selge lahuse kiht. Võtsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilgakese lahust ja kandsin erinevatele filterpaberi tükikestele. Lasin kuivada ning vaatlesin siis pabereid vastu valgust ning ka tumeda ala poole. Tulemus: Sellel paber, kuhu oli tilgutatud lahust, mis oli võetud esimesest katseklaasist (rasvapleki proov I), oli vastu valgust vaadeldes selgelt näha heledamat suurema läbipaistvusega ala ning vastu tumedamat pinda vaadates tumenenud ala
suurusjärk. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimislahustesirge koostamiseks Glükoosi standardlahus sisaldab 1,0 mg/mL glükoosi. Standardlahusest valmistasin 3 lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL ja 0,062 mg/mL. Lahjendatud glükoosilahuste tegemiseks võtsin kolm puhast ja kuiva katseklaasi. Aga edasi, kuidas toimisite Lahjendamisel toimisin järgnevalt: Pipeteerisin standardlahusest 2,5 ml. Lahjendasin selle 7,5 ml veega. Loksutasin korralikult. Sellest omakorda pipeteerisin järgmisesse katseklaasi 5ml, lisasin 5ml vett, loksutasin korralikult. Sellest omakorda taas 5 ml lahust ja lisan 5ml vett, loksutasin. Lahjendamisel lähtusin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub võrdne ainehulk. C standard ×V standard =Clahjendus ×V lahjendus Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL. Millise lahuse Lahjendatud glükoosilahustel oli lahuse kogumahuks 10 mL
produtseeritakse 1 mikromool produkti. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. · Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisasin sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne lahjendus. · Katseklaasi sulgesin korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine. · Võtsin 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%- line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. · Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin umbes 5 10 minutiks vesitermostaati juurde soojenema. · Võtsin 3 koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Komplekslahus oli erksinine.
Lahjendamisel lähtsuin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja lahjendatud lahuse lõpmahus sisaldub võrdne ainehulk. Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL. Lahjendatud glükoosilahuste tegemiseks võtsin kolm puhast ja kuiva kaliibritud katseklaasi. Valmistasin standardlahusest 10 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Selleks pipeteerisin I katseklaasi 2,5 mL standardlahust ja täitsin destilleeritud veega kuni 10 mL-ni. Loksutasin. Lahjendasin saadud lahust kaks korda (II katseklaas) ning saadud teist lahust veel omakorda kaks korda (III katseklaas). Loksutasin. Värvusreaktsiooni läbiviimine Nummerdasin 6 puhast ja kuiva katseklaasi, asetasin need statiivi. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 mL destileeritud vett. See oli kontroll- ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni. Katseklaasidesse nr 2 ja nr 3 pipeteerisin kummasegi 1 mL uuritavat lahust ehk sidrunimahla (2 paralleelproovi)
reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta. TÖÖ KÄIK: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. Töölahuse maht on 10 ml ning vedela preparaadi maht on 1:40 ehk 10/40=0.25 ml. Mõõtsin selle automaatpipetiga katseklaasi ning lisasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4.8. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine. · Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4.8.Panin katseklaasile kile peale ja asetasin umbes 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1 kraadi juurde soojenema. · Võtsin 3 koonilist kolbi (250ml) ja pipeteerisin neisse 10 ml komplekslahust. Viisin
Katse õnnestus, sest minu tulemuseks oli 21,9 mg-ekv / kg. C-vitamiin Askorbiinhappe määramine Töö käik Peenestasin 4,07 g kollast paprikat uhmris kvartsliivaga hõõrumisel lisades vähehaaval 5%- list äädikhapet, et kaalutis oleks kogu aeg kaetud vedelikuga. Peenestatud segu viisin lehtri abil kvantitatiivselt 100 ml-sse mõõtkolbi, kasutades pesemiseks 5%-list CH3COOH ja täitsin kolvi sama lahusega kriipsuni. Sulgesin kolvi, loksutasin ja jätsin 10 minutiks seisma, aeg- ajalt loksutades. Seejärel filtreerisin lahuse. Pipeteerisin 10 ml filtraati koonilisse kolbi ning lisasin 0,4 g CaCO3, et viia lahuse pH 5-ni. Vahutamise lõppedes lisasin pipetiga 5 ml 5%-list Pb-atsetaadi lahust äädikhappes valkude ja redutseerivate ainete sadestamiseks, loksutasin, filtreerisin. Pipeteerisin väiksesse koonilisse kolbi 10 ml filtraati, lisasin 1 ml 2%-list HCl ning 4 ml
hajutavad läbivat valgust. Kui orgaanilises solvendis lahustatud rasv viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt loksutada, tekib õli-vees tüüpi emulsioon. Töö käik Kahte kuiva katseklaasi valasin 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutatasin. Seejärel lisasin mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutasin veel. Lipiidi sisaldavas katseklaasis muutub segu häguseks. Järeldus:Hägusus tekkis teise proovi sisaldavas katseklaasis, seega see sisaldab lipiide. 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides Küllastumata rasvhapete esinemist lipiidides uuritakse halogeenidega reaktsiooni abil. Küllastunud rasvhappeid sisaldav proov moodustab broomiga pruuni värvuse, küllastumata rasvhapete korral muutub lahus momentaalselt värvituks.
mahu taitmiseks kuni kaelal oleva margini. Uuritav proov. Kaalusin analuutilisel kaaludel kaaluklaasi 0,1019 g mett, viin teda kvantitatiivselt 25 ml mootekolbi. Tegin seda kuuma dest. Veega, mida lisasin vaikeste portsionitega 3 korda kaaluklaasi, klaasi sisu segasin vaikese klaaspulgaga ja tekkinud lahus valasin lahtri abil mootekolbi. Taidsin ca 1/3 kolvi mahust kuuma dest. veega ja kolbi hoidsin veevannis veel20 min, aeg-ajalt loksutasin. Parast jahutasin toatemperatuurini. Glukoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. Glukoosi standartlahust valmistasin 1,0 mg/ml glukoosi konts. Lahusest. Valmistasin kolm lahjendust, mille glukoosi konts. On vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks votsin kolm puhast katseklaasi, kuhu pipeti abil mootsin eelnevalt valjaarvutatud kogus glukoosi standartlahust ja lisasin dest. vett margini. Katseklaasi sulasin
liigutustega. Tegin saadud lahusest 5 kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin destilleeritud veega loputatud 100 ml mõõtekolbi 20 ml lahust. Enne vajaliku koguse pipeteerimist loputasin pipetti iga kord selle lahusega läbi s.t. et ma loputasin iga kord pipetid (ja ka büreti) töölahusega ning alles siis mõõtsin endale katseks vajaliku koguse lahust. Lisasin 20 ml lahusele nii palju destilleeritud vett, et 100 ml mõõtekolb oleks vastava kriipsuni täidetud. Loksutasin saadud lahust intensiivselt. Pipeteerisin destileeritud veega loputatud koonilisse kolbi 10 ml 5 kordse lahjendusega HCl lahust ning lisasin 3 tilka fenoolftaleiini. Büreti täititsin nullini täpse kontsentratsiooniga 0,1004 NaOH lahusega. Hakkasin tiitrima. Tilk haaval hakkasin büretist lahust tilgutama koonilisse kolbi, kus oli 5 kordse lahjendusega HCl lahus ning 3 tilka fenoolftaleiini. Lahuse värvus muutus roosaks, kuid kui seda loksutasin, siis värvus kadus
taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Töö käik Tegin oma vedela invertaasi preparaadist 40 kordse lahjenduse. 10 ml lahuse kohta 0,25ml invertaasi. Kasutasin automaatpipetti 250 mõõduga, millega viisin mõõdetud invertaasi gradueeritud katseklaasi ja lisasin 10ml märgini puhverlahust. Loksutasin ühtlase konsentratsiooni saamiseks. Lisasin 50ml-sse katseklaasi 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaasile panin peale korgi ning asetasin vesitermostaati 30 juurde soojenema. Panin valmis kolm 250ml koonilist kolbi, igaühesse lisasin pipetiga 10 ml komplekslahust. Substraadi soojenemisel 30-ni lisasin sellele 1 ml uuritavat invertaasi töölahust.
lahusega jällegi laguneb ning võimaldab Cu(II) ioonidega triloon B kompleksi taastekke. Töö käik 1. Valmistasin sobiva kontsentratsiooniga ensüümi lahuse. Uurisin vedelat preparaati, seega lisasin 0,25 ml vedelat preparaati pipetiga gradueeritud katseklaasi, millele lisasin atsetaatpuhvrit (pH=4,8) kuni lahuse maht oli 10 ml. Seega teostasin 40 x lahjenduse. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. 2. Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7% sahharoosi lahus atsetaatpuhvris(pH=4,8). Katseklaasile panin korgi peale ning asetasin 10 minutiks vesitermostaati 30±1C° juurde. 3. Võtsin kolm 250 ml koonilist kolbi, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust, milleks oli Cu(II)-triloon B kompleks. 4
Ensüümpreparaadi töölahuse valmistamine Praktikumi juhendaja näpunäidete järgi valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümi kontsentratsiooniga lahust (nn töölahust). Lahustina kasutasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Vedelat invertaasi lahust lahjendasin puhvriga 50 korda, ehk pipeteerisin automaatpipetiga gradueeritud katseklaasi 0,2 ml invertaasi lahust ja seejärel täitsin katseklaasi kuni 10 ml-ni puhverlahusega. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine Kõigepealt võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH-väärtusega 4,8. Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin 5-10 minutiks vesitermostaati 30+-1oC juurde soojenema. Seejärel võtsin kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viisin
millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus (pidevas faasis) Kuna Emulusioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks. Töö käik: Kirjeldage konkreetselt testi läbiviimist! Emulusioonid uuritavad lahused olid valmis – Emulusioon I ja Emulusioon II. Üks nendest vesi-õli tüüpi emulusioon, teine õli-vesi tüüpi emulusioon. Mõlemasse lisasin 4ml destilleeritud vett ja loksutasin intensiivselt. Emulusiooni II segu läks loksutamisel häguseks. Tulemus: Katseklaasis, kus oli Emulusioon I ei muutunud loksutamise tulemusena midagi, proov jäi läbipaistvaks, katseklaasis, kus oli Emulusioon II läks segu häguseks. Järeldus: Emulusioon II sisaldas lipiide 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides Küllastumata rasvahepete esinemise kindlakstegemisel kasutatakse reaktsiooni halogeenidega – täpsemalt broomiga
proovist tekkinud proov oli läbipaistev. Seega teginjärelduse, et lipiide sisaldub 1. proovis. Õppejõuga kontsulteerides selgus aga, et tegelikult peaks lipiide sisaldama 2. mitte 1. proov. Kuna proove võeti katseklaasi sama spaatli erinevate otstega, siis ilmselt oli keegi spaatli otsad segamini ajanud ja proovi rikkunud. 2.Emulsioonitest Valasin kahte kuiva katseklaasi 2ml 96% etanooli ja lisasin 2 ml kahte erinevat lahust, millest üks sisaldas lipiide ja teine mitte. Loksutasin mõlemat katseklaasi hoolikalt. Seejärel lisasin 4ml destilleeritud vett. 1. Proovi sisaldanud lahus muutus häguseks. See on lipiidide olemasolu kinnituseks. 3.Akroleiiniproov Lisasin kahte katseklaasi 1g NaHSO4 ja lisasin kummalegi mõne tilga erinevatest akroleiiniproovidest. Kuumutasin segusid gaasipõleti leegil. Ühes katseklaasis olev segu muutus tumedaks (proov 2), moodustus akroleiin, teises mitte (proov 1) . Järelikult leidus esimeses proovis glütserooli, teises aga mitte. 4
Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde umbes 510 minutiks 3. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust 4. Termostaadis olevevale kaseiinilahusele lisasin ensüümi ning märkisin reaktsiooni alguse aja üles. 5. Peale ensüümi lisamist võtsin puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viisin TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov) ja loksutasin. Reaktsioonisegu asetasin tagasi termostaati. 6. 5 minuti ja 45 sek pärast võtsin sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja loksutasin. Samas asja kordasin veel kaks korda 5-minutiliste intervallidega. 7. Jätsin proovid settima 15 minutiks ning filtreerisin iga proovi ümber. 8. Spektrofotomeetril mõõtsin proovide optiliste tiheduste väärtused lainepikkusel = 280 nm.
lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub üks ja sama ainehulk ehk kehtib võrrand Cst • Vst = Clahj • Vlahj Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. Glükoosilahuste (lahjenduste) tegemisel lähtusin kõrvalolevast skeemist. Selleks valmistasin glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml (2,5 ml töölahus + 7,5 ml dest. vesi), loksutasin. Seejärel lahjendasin seda glükoosilahust 2 korda (5 ml esimene lahus + 5 ml dest. vesi), loksutasin. Saadud teist lahjendust lahjendasin veel 2 korda (5 ml teine lahus + 5 ml dest. vesi), loksutasin. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks on vaja 6 puhast, kuiva ja nummerdatud katseklaasi. Katseklaasi nr 1 pipeteeritakse 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov).
lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks. Töö käik Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: 1. palmiithappe 2. rapsiõli 3. searasv. Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval 7 tilka broomi lahust kloroformis e triklorometaanis ja loksutasin Tulemus ja järeldus Katseklaas palmiithappega säilitas kollakas-pruuni värvuse, teised on värvuseta. Võib järeldada, et ainult palmiithappe sisaldab küllastunud rasvhappeid, rapsiõli ning searasv sisaldavad küllastumata rasvhappeid. 1.3.2 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas-rohelise värvusega reaktsioonisegu
annaabi.ee 
