Biokeemia praktikumi protokoll 1.3 ja 2.2 (juh. Terje Robal) (0)

Töö 2.2 teoreetiline osa
Karotenoidid – fotosünteesi abipigmentid, mis asuvad taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides (ka teistes fotosünteesivates organismides) ja absorbeerivad valgust klorofüllist erinevatel lainepikkustel ning on täienduvateks kiirguse retseptoriteks, aga täidavad taimedes ka kaits .
Karotenoidid (>600) klassifitseeritakse kui tetraterpenoide, struktuurilt on nad polüeensed ahelad , mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Lükopreen – kõige pikema ahelaga karotenoid .
Karotenoidide kaks põhigruppi on: karoteenid (ei sisalda O2 , lükopreen, α-,β-,δ-, γ-, ζ- karoteenid, ..) ja ksantofüllid (sisaldavad O2, luteiin , zeaksantiin, ..)
Loomsetele organismidele on neli karotenoidi (α-,β- ja γ- karoteen ning β-krüptoksantiin) vitamiini A eelühenditeks. Vitamiin A esmaseks funktsiooniks on nägemisprotsessi tagamine, lisaks sellele on ta antioksüdant ja kaitseb silmi kahjuliku sinise ja UV-kiirguse eest.
Hulkraksetes organismides lükopreen ja β-karoteen mangivad tähtsad rolli rakkudevahelises suhtluses , stimuleerides valk konnektsiini ekspressiooni.
Loomsed organismid omastavad karotenoide taimse toiduga.
Karoteeni isomeeridest omab suurimat tähtsust β-karoteen. Looduslikest objektidest isoleerituna esineb ta punakas-oranžide kristallidena, ei lahustu vees ja vesilahustes, kuid lahustub apolaarsetes orgaanilistes lahustites ( petrooleeter , bensiin , dietüüleeter), optilist aktiivsust ei oma.
Karotenoidid neelavad valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel (400-700)ja peegeldavad pikematel lainepikkustel – see tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus.
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi.
Töö käik ja tulemuste analüüs
Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist

Eelnevalt kaalutud 0,6 g tomati peenestasin uhmris pestud liivaga ühtlase massi saavutamiseni.

Lisasin veevaba Na2SO4 et materjalis sisalduvat vett siduda kuni pulbrilise massi saavutamiseni.

Valmistasin 25ml mõõtsilinder ja varustasin see sobiva suurusega klasslehtriga paberfiltriga.

Tegin ekstraktsiooni heptaaniga (d = 0,72 g/cm3), määrasin kindlaks ekstrakti kogumaht: 22,5 ml
Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs
Mõõtsin karotenoidide neeldumisspektri lainepikkuste vahemikus 350-650 nm kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (heptaani). Töötasin klassküvettiga.

max1: A=0,1526 ABS; λ= 505 nm lükopeen (E% 1cm) = 3150

max2: A= 0,1932 ABS; λ= 473 nm lükopeen (E% 1cm) = 2250

max3: A= 0,1429 ABS; λ= 448,5 nm luteiin (E% 1cm) = 2480
Tegemist on karotenoidide seguga . Ekstraktis domineerib karoteeni isomeer lükopeen.
Karotenoidi sisalduse arvutamine ( kvantitatiivne analüüs)
K = (A*V*d*103) / (E1%1cm *g) mg%
A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile = 0,1932 ABS
E1%1cm – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient neeldumismaksimumi juures =3450
V – ekstrakti kogumaht = 22,5 ml
d – kasutatud ekstrahendi tihedus = 0,72 g/cm3
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass = 0,6g
103 – tegur milligrammidele üleminekuks
K = (0,1932 * 22,5 * 0,72 * 1000) / (2250 * 0,6) = 2,3184 mg%
Kirjanduse alusel sisaldab tomat 7,85 mg% lükopeeni. Minu tulemus oluliselt erineb, töö ei õnnestunud väga hästi.
Töö 1.3 teoreetiline osa
Lipiidid – heterogeenne ühendite rühm, iseloomulik estersidemete esinemine, reeglina ei lahustu vees ja vesilahustes, vaid lahustub apolaarsetes orgaanilites solventides (triklorometaan, tetraklorormetaan, benseen , eeter , ..). Lahustumatus vees on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmide ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldumisest molekulis. Lipiidid on rakumembraanide põhiline komponent , loomsetes organismides ka energeetiliseks varuaineks. Lisaks on neil ka kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid.
Klassifikatsioon :

• Rasvhapped
  
• Rasvad
  
• Glütserofosfolipiidid
  
• Sfingolipiidid
  
• Vahad
  
• Steroidid
  
• Terpenoidid
  

• Seebistuvad (rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad)
  
• Mitteseebistuvad ( steroolid , prostaglandiinid, terpenoidid)
  

• Lihtlipiidid (neutraalrasvad ja vahad)
  
• Liitlipiidid (fosfo- ja glükolipiidid)
  
• Tsüklilised lipiidid (kolesteriidid)
  

RASVAD=triglütseroolid on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Sobivad toiduenergia säilitamiseks. Neutraalsetes rasvades sisaldub lai valik erinevaid küllastunud ja küllastumata rasvhappeid . Inimesele on eriti tähtsad linool - ja α-linoleenhape, kuna neid peab inimene saama toidurasvadega. Looduses esinevad küllastamata rasvhapetel kaksiksidemed valdavalt cis-konfiguratsioonis
GLÜTSEROFOSFOLIPIIDID on kõikide rakumembraanide peamine koostisosa, nad on amfifiilsed (amfipaatsed) molekulid, kus on polaarne tsenter tänu fosforhappe jääki. Amfipaatsuse tõttu moodustavad need lipiidid vesikeskonnas membraanid , vesiikulid või liposoomid.
STEROOLID ehk STEROIDALKOHOLID ehituselt koosnevad steraanituumast, mis asendis C-3 on hüdroksüleeritud. Võimelised moodustada rasvhapetega estreid – steriidid. Levinuim loomne sterool on kolesterool (tagab membraani läbitavus ja voolavus) millest toodetakse sapphappeid, steroidhormoone ning D-vitamiini.
Töö käik ja tulemuste analüüs
1.3.1 Rasvaplekiproov

Võtsin kaks kuiva katseklaasi, millesse panin 1 g tahket uuritavat ainet

Mõlemasse katseklaasi lisasin 0,5 ml tetraklorometaani, loksutasin

Jäin tahke materjali settimiseks 5 minutit seista

Kui sademe kohale on tekkinud selge lahuse kiht, siis kandsin mõlemast katseklaasist pipetiga tilk lahust filterpaberile ja jäin kuivada
Mõlemad rasvaplekkid olid vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam, kuna lipiidid suurendavad paberi läbipaistvus => mõlemad uuritavad ainet sisaldasid lipiide
1.3.2 Emulsioonitest

Võtsin kaks kuiva katseklaasi kuhu valasin 1 ml erinevat uuritavat lahust

Lisasin mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutasin intensiivselt
Ühes katseklaasis muutus segu häguseks => seal on lipiidid, täpsemalt rasvad, kuna nad on hüdrofoobsed ja moodustavad vesikeskkonnas emulsiooni ning hajutavad läbivat valgust.
1.3.3 Akroleiiniproov

Võtsin kaks kuiva katseklaasi kuhu kandsin 1 g NaHSO4 ja lisasin tilk kahest erinevast uuritavast materjalist

Kuumutasin katseklaasid tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamise ja proovi tumenemiseni (akroleiini moodustumiseni)

Nuusutasin ettvaatlikult katseklaasidest eralduva lõhna
Esimene proov sisaldas glütserooli (glütserooli sisaldavaid lipiide: rasvad ja glütserofosfolipiidid), kuna seal tekkis terav lõhn (akroleiinist).
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides

Kolme puhasse ja kuiva tatseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust (1 rasvhappe – palmitiinhape; 2 taimne rasv – päevalille õli; 3 loomne rasv – searasv )

Kõigisse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval võrdne kogus broomi lahust kloroformis, loksutasin ja jälgisin toimuvaid muudatusi:
1: säilitasin kollakas-pruun värvus
2: muutus värvituks
3: muutus värvituks
Katseklaasides kus värvus muutus värvituks olid küllastamata rasvhapped, kuna nad reageerisid broomiga, aga küllastunud rasvhapped (nt palmitiinhape) ei reageeri Br2.
1.3.5 Liebermann -Burchard’I kolesterooli määramise test

Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis – kolesteroolilahust, taimse (päevalille õli) ja loomse (või) rasva lahust.

Igasse katseklaasi lisasin 7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4 tilka konts. Väävelhappet ning loksutasin hoolikalt

Jälgisin katseklaasides toimuvaid värvuse muutusi
Kolesterooli sisaldavas katseklaasis muutus värvus sinakas -roheliseks, kuna seal toimus küllastamatuse suurenemine ja sulfoneerumine erinevates punktides. Teistes katseklaasides sellist muutust ei toimunud, kuna taimne ja loomne rasv ei sisalda kolesterooli.