Biokeemia praktikumi protokoll 1.1 ja 1.2 (juh. Terje Robal) (0)

Töö teoreetiline osa, töö käik ja tulemuste analüüs
PARANDUSED
Kvalitatiivsete reaktsioonide abil saab uurida, kas on mingil materjalil teatud keemilise elemendi funktsionaalne rühm, ühendite rühm või ei ole.
VALGUD - polüpeptiidid (aminohappejäägid seotud peptiidsidemetega), omavad 4 struktuuri. Valkude detekteerimiseks(=kindlakstegemiseks) kasutatakse: värvusreaktsioonid, väljasadestamine, väljasoolastamine. Kvalitatiivsed reaktsioonid: universaalsed (üldreaktsioonid) ja spetsiifilised ( erireaktsioonid ).
BIUREEDIREAKTSIOON
Kasutatakse et määrata ühendit millel on kaks või enam peptiidsidet  aluselises keskonnas Cu2+-ioonidega moodustavad violetse kompleksi. Valkude üldreaktsioon.
1ml munavalgu

1ml 10%-list NaOH, 1 tilk 1%-list CuSO4

Loksutasin
Lahus muutus sinakasvioletseks => Cu2+- ioonid moodustusid valgumolekulidega biureetkompleksi => lahuses olid valgud.
KSANTOPROTEIINREAKTSIOON (MULDERI REAKTSIOON )
Kasutatakse et määrata aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu. Konts. lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub, soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine (kollane).
1ml munavalgu

6 tilka konts. HNO3

Loksutasin ja soojendasin

Jahutasin ja lisasin NH4OH
Konts. Lämmastikhappe lisamisel tekkis sade => valk denatureerus pöördumatult, pärast soojendamist lahus muutus kollaseks => nitreerisid aromaatsed tuumad Tyr, Trp ja Phe aminohapetes. NH4OH lisamisel lahus muutus oranžiks ja tekkis ammoniaagi lõhn => munavalgus on Tyr, Trp, Phe aminohaped.
MILLONI REAKTSIOON
Milloni reaktiiv : elavhõbe(II) nitraadi lahus lämmastihappes vähese NaNO2 lisandiga. Kasutatakse et määrata finoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid (valkude puhul – Tyr radikaalid). Suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni.
Ühte katseklaasi valasin 1 ml munavalgu lahust, teise 1ml želatiini lahust.

Mõlemasse lisasi 6 tilka Miloni reaktiivi.

Soojendasinreaktsiooni segu 50 graadini ning jälgitasin toimuvaid muudatusi
Katseklaasis kus oli munavalk tekkis valge sade natuke roosaga, kus oli želatiin – on läbipaistev roosa lahus => želatiinis on palju türosiini (Tyr) radikaale, munavalgus on neid vähe.
SULFHÜDRÜÜLI- e TIOOLREAKTSOON
Näitab Cys esinemist valgus
Panin katseklaasi 2ml Pb( CH3COO )2 0.5%

Lisasin tilgakaupa 10%-list Na OH kuni tekkiv sade kaos ja moodustus naatriumplumbaat

Lisasin 1ml munavalgu

Loksutasin ja soojendasin 1 minut, seejärel panin statiivi
Soojendamisel lahus algas muutuma prunikasmustaks ning pärast soojendamist muutus täiesti prunikasmustaks kolloidse sademega => tsüsteiinis (Cys) sisalduv –SH rühm moodustus leeliselise hüdrolüüsi tõttu tumepruuni PbS sademe => valgus on Cys aminohape .
VALKUDE SADESTAMINE TRIKLOROÄÄDIKHAPPEGA
TKÄ denatureerib valke  valkude eraldamine madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest.
1ml munavalgu

Lisasin 1 tilk CCl3COOH lahust

Loksutasin
Tekkis valge sade => valk denatureeris => on olemas valgud, kuna see reaktsioon eraldub valgud madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest.
VALKUDE VÄLJASOOLASTAMINE (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Neutraalsed soolad ((NH4) 2SO4 , MgSO4 , NaCl ja teised) põhjustavad pöörduvat denaturatsiooni . Globuliinid sadestuvad poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestumiseks on vaja soola küllastunud lahust. Sadestumisele mõjutavad valgu hüdrofiilsus/hüdrofoobsus, laeng, molekulmass ,..
2ml munavalgu

Lisasin 1ml (NH4)2SO4 küllastunud lahus

Loksutasin ja jäin 5 minutiks seisma

½ Globuliinide sade eraldasin filtrimise teel (filterpaber ja klaaslehter)

Saadud filtraadile lisasin kristalset (NH4)2SO4 kuni kristallid enam ei lahustu

Jälgisin albumiinide sademe moodustumist

Võrdlesin
Alguses tekkis globuliinide sade, kuna nende denaturatsiooniks piisab poolküllastunud lahust, pärast filtrimist ja kristallide lisamist tekkis albumiinide sade.
VALKUDE TERMILINE DENATUREERIMINE JA LAHUSTUVUSE SÕLTUVUS pH-st
pl (valgu isoelektriline täpp) – näitab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, seega molekuli summaarne laeng võrdub 0-ga. Kui keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu pl väärtusest väljasadestumist ei toimu.
Kahte katseklaasi valasin 2 ml munavalgu lahust

Ühte katseklaasi lisasin 1 ml konts. Etaanhapet

Mõlemaid kuumutasin keeval vesivannil
Lahuses kus oli ainult munavalk tekkis sade, kuna etaanhappe lisamine teisesse katseklaasi muutus keskkona pH väärtuse => erineb ta tunduvalt valgu pI väärtusest =>valk ei sadestu.
VALKUDE SADESTAMINE ORGAANILISTE LAHUSTITEGA
Veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides (esile aminohapete apolaarsete radikaalide) pöördumise molekulide välispinnale. Valgu dehüdratiseerumine valk sadestub (denatureerub pöörduvalt)
2ml munavalgu lahust

Tilgakaupa ja loksutades lisasin etanooli, tekkis sade

Lahjendasin veega , sade lahustus
Etanooli lisamisega valk dehüdratiseerus ja sadestus => valk denatureerus pöörduvalt, kuna vee lisamisega sade kaos.
SÜSIVESIKUD - polümeerid, monomeerid – monosahhariidid (monoosid = lihtsuhkrud ), seotud O-glükosiidsidemega. On olemas mono -, oligo-, polüsahhariidid. Monosahhariidid erinevad stereostruktuurilt  erinevad omadused. Keemiliselt ehituselt on nad kas lineaarsed polühüdroksüaldehüüdid või polühüdroksüketoonid või tsüklilised poolatsetaalid või poolketaalid. Tänu aldehüüd-/ketorühma esinemisele  redutseerimisvõime. Oligosahhariidid : kui on vaba hemi- e poolatsetaalne/poolketaalne hüdroksüülrühm, siis nad on redutseerivad (=taandavad), kui ei ole – siis mitteredutseerivad.
Kvalitatiivne määramine – karbonüülrühma esinemine molekulis (hõbepeegli reaktsioon, reaktsioon Fehlingi lahustega ,..).
Süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul moodustuvad heterotsüklilised aldehüüdide furfuraalid või 5-hüdroksümetüülfurfuraalid (Molisch’i test, Selivanoffi’i reaktsioon).
MOLISCH’I TEST
Kvalitatiivse analüüsi põhitest, kuna positiivse reaktsiooni annavad nii mono-, oligo- kui polüsahhariidid (isegi nukleiinhapped ja glükoproteiinid). Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad  furfuraalid või 5-hüdroksümetüülfurfuraalid  reageerivad edasi a-naftooliga, moodustades purpurse kihi.
Ühte katseklaasi valasin 2 ml glükoosi (monosahhariid) lahust ning teisesse 2 ml laktoosi( oligosahhariid ) lahust

Mõlemasse lisasine 6 tilka Molisch’i reaktivi

Loksutasin

Hoides katseklaasi kaldasendis lisasin ettevaatlikult tilkhaaval 1ml konts. Väävelhapet
Moodustusid purpuursed kihid lahuse ja happe piirpinnale => on olemas süsivesikud
OSASOONIDE SAAMINE
Osasoonid – redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga (liiga) tekkinud süsivesikute derivaadid . Kas mono- või oligosahhariidid. Lähtesuhkrute kristallide kuju ja s-t on iseloomulikud. On vaja pikemaajalist kuumutamist. Osasoonide järgi on võimalik eristada suhkruid, mille stereostruktuurid erinevad vaid ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni poolest.
Ühte katseklaasi valasin 2ml laktoosi, teisesse 2 ml galaktoosi

Mõlemasse lisasin 0.1 g tahket fenüülhüdrasiini ja 0.2 g kristallilist naatriumtsetraati

Loksutasin kuni ained on lahustunud

Hoidsin reaktsioonisegu 40 min keevas vees veevannis, loksutasin aeg-ajalt

Jahutasin jäävannis
Tekkisid erinevad osasoonid. Laktoosi osasoonid on suuremad ja pikkemad kui galaktoosi osasoonid. Kuna osasoonid on erineva kujuga see tähendab, et kasutatud suhkrud on ka erinevad, ja tõesti galaktoos on monosahharid, aga laktoos on oligosahhariid.
HÕBEPEEGLI REAKTSIOON
Redutseerivates suhkrudes aldehüüdrühm taandab mitmete metallide sooli . Saadestub peegel katseklaasi pinnal Tolleni reagendi toimel.
Pestsin hoolikalt katseklaas

Valasin 1ml 1%-list AgNO3

Lisasin 0.5 konts. NH4OH ja loksutasin

Lisasin 1ml glükoosi lahust, loksutasin

Soojendasin veevannis
Katseklaasi seina sadestus taandunud hõbe => glükoos on redutseeriv suhkur ja sisaldab aldehüüdrühma, sel juhul poolatsetaalset hüdroksüülrühma, kuna glükoos on tsüklilise vormiga.
SAHHAROOSI HÜDROLÜÜSI KONTROLL FEHLINGI LAHUSTEGA
Fehlingi reaktiiv (leeliseline vask(II)tartraatkompplekt) – levinud reaktiiv taandavate suhkrute määramisel. Inversioon – sahharoosi hüdrolüüsi protsess. Invertsuhkur – tekkiv glükoosi ja fruktoosi segu (1:1 mool ). Sahharoos ei ole taandav suhkur, kuid glükoos ja fruktoos on.
Kahte katseklaasin valasin 1 ml sahharoosi lahust

Ühte neist lisasin 1 tilk kont. HCl, loksutasin

Mõlemad katseklaasid hoiasn 5 min veevannis 80 graadi juures

Lisasin mõlemasse katseklaasi Fehlingi I ja II lahust ja loksutasin => intensiivne sinine värvus

Soojendasin neid uuesti veevannli kuni ühes katseklaasis tekib punane sade
Katseklaasis kus oli HCl tekkis punane sade, sest HCL lisamisega sahharoosi lahusele kiirendas tema hüdrolüüs ja tekkis ekvimolaarne segu glükoosist ja fruktoosist, need on taandavad suhkrud ning nad andsid positiivse reaktsiooni. Vask(II)-tartraatkompleks reageerib aldoosidega (glükoos ja fruktoos) ja ketoosidega, mille tulemusena vask taandub, andes punase sademe (vask(I)oksiidi), glükoos ja fruktoos aga oksüdeerisid vastavateks happeteks.
BARFOED’ REAKTSIOON
Eristab taandavaid monosahhariide oligosahhariididest Barfoed reaktiiviga, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid, andes punase vask(I)oksiidi sademe.
Ühte katseklaasi valasin 1 ml fruktoosi ning teisesse 1 ml maltoosi

Mõlemale lisasin 3ml Barfoed’ reaktiivi, segasin ja hoidsin kuumal veevannil 3 minutit
Kus oli fruktoos punane sade tekkis 2 minuti jooksul , kuna fruktoos on taandav monosahhariid.
SELIVANOFF ’I REAKTSIOON
Kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustub pentoosidets heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal. Reageerides mitmealuseliste fenoolidega annavad värvilisi produkte (kasutatakse ka kvantitatiivseks määramiseks). Seliffanov’i reaktiiv – benseen -1,3-diool[C6H4(OH)2] ja katalüsaator FeCl3. Ketoosidega reaktsioon toimub kiiremini kui aldoosidega.
Ühte katseklaasi valasin 1 ml fruktoosi, teisesse 1 ml glükoosi

Lisasin Selivanoff’i reaktiivi, loksutasin

Soojendasin 4 min keeval veevannil
Fruktoos muutus värvust oranžiks palju kiiremini kui glükoos, kuna fruktoos on ketoos, aga glükoos on aldoos.
TÄRKLISE REAKTSIOON JOODIGA
Tärklis moodustub joodiga lillakas -siniseid komplekse. Tekkinud kompleks laguneb kõrgemal temperatuuril ja kaob värvuse (pöörduv), jahutamisel – värvitub uuesti. Erinevad suurused ja kuju (nähtav mikroskoobi all) võimaldavad eristada millisest taimest tärklis pärineb.
Valasin 5 ml tärkliselahust

Lisasin 1 tilk joodilahust

Loksutasin ja kuumutasin keemiseni

Katseklaasi alumine pool jahutasin jäävee vannil
Joodilahuse lisamisega lahus muutus tume lillakas-siniseks, kuna toimus tärklise (polüsahhariid) ahelate keerdumine joodi molekulide ümber. Kuumutamisega lahus muutus läbipaistvaks, kuna kompleks pöörduvalt lagunes . Jahutamisel värv jälle ilmus, kuna kompleks taastus.

Kartuli tärklise terade kuju on suurem kui maisi oma.