Valgud ja Süsivesikud (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia I labor : 1.1 Valgud ja 1.2 süsivesikud
Üliõpilane: Silvia Laiv 112429 KATB41
Juhendajad: Kaia Kukk; Priit Eek

1.1 Valgud

1.1.1 Biureedireaktsioon
Katse tõestab kahe või enama peptiidsideme esinemist ühendis. Antud tingimustele vastavad ühendid värvuvad Cu2+ ioonidega kompleksi moodustades violetseks. See on valkude üldreaktsioon. Cu2+ ioonid seostuvad peptiidsidemesse kuuluvate nelja lämmastiku aatomiga ning sellest on tingitud reaktsioonis toimuv värvi muutus. Värvi intensiivuss sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.
Töö käik:
Katseklaasi valasin u. 1ml munavalgu lahust, lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja 2 tilka 1%-list CuSO4 lahust. Loksutasin katseklaasi sisu. Värvuse muutus toimus suhteliselt kiiresti ning vesivannil soojendamist ei vajanud.
Järeldus:
Sellest katsest saab järeldada, et munavalgu lahus on valgu lahus, ehk sisaldab kaht või enamat peptiidsidet.
1.1.2 Ksantoproteiinireaktsioon (Mulderi reaktsioon )
Selle katsega saab määrata aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete olemasolu valgus (Tyr, Phe, Trp). Valk denatureerub pöördumatult ja sadestub kui lisada sellele konts. Lämmastikhapet. Katseklaasi soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Tekkinud nitrofenooli ühend on intensiivse kollase värvusega, käitudes hape /alus indikaatorina.
Töö käik:
Valasin katseklaasi u. 1ml munavalgu lahust ja lisasin 5 tilka konts. HNO3. Loksutasin segu ja soojendasin vesivannis. Kuumutamisel muutus eelnevalt tekkinud sade helekollaseks. Jahutasin segu ning lisasin mõned tilgad NH4OH lahust, kuni tekkis kerge ammoniaagi lõhn, ning loksutasin segu uuesti. Sade värvus sügavaks erksaks kollaseks.
Järeldus:
HNO3 lisamisel tekkis valge sade, mis kuumutamisel muutus helekollaseks- järelikult oli valgus mõni järgmistest aminohapetest (Tyr, Trp, Phe). Ammoniaagi lisamisel värvus sade tumedamaks erksaks päikesekollaseks- järelikult täitis nitrofenooli ühend oma hape/alus indikaatori ülesannet värvudes aluselises keskkonnas tumekollaseks-oranžiks.
1.1.3 Milloni reaktsioon
Reaktsiooni jaoks on vaja kasutada Milloni reaktiivi, mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Selle reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, valkude puhul türosiini radikaalid. Türosiini esineb enamus valkude koostises, suurem osa valke annab positiivse reaktsiooni. Positiivses reaktsioonis värvub valgu sade või lahus soojendamisel roosaks kuni telliskivi punaseks.
Töö käik:
Vaja on kaks katseklaasi. Ühte katseklaasi valasin u. 1ml munavalgu lahust, teise u. 1ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisasin 5 tilka Milloni reaktiivi (munavalgu lahuses tekkis sade) ning soojendasin mõlemat katseklaasi vesivannis. Soojendamise käigus želatiini lahuses muutusi ei toimunud, munavalgu lahuses olev sade värvus heleroosaks.
Järeldus:
Katsest saab järeldada, et munavalk sisaldab fenoolset hüdroksüülrühma, želatiin aga mitte.
1.1.4 Sulfhürüüli- e tioolireaktsioon
Tioolireaktsioon tõestab tsüsteiini esinemist valgus. Selle koostises olev sulfhüdrüülrühm allub leeliste hüdrolüüsile, andes sulfiidioone, mis moodustavad PB2+ ioonidega musta või tumepruuni ülipeene pliisulfiidi sademe.
Töö käik:
Katseklaasis olevale 2 ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisasin tilgakaupa 10%-list NaOH lahust kuni Pb(OH)2 sade kaob ja moodustub Na2PbO2 (lisasin NaOH tõenäoliselt liiga palju, kuna ei osanud märgata, et Pb(OH)2 sade tekkis väga kiiresti ja oli väga peen). Siis lisasin katseklaasi 1ml munavalgu lahust ning loksutasin ja soojendasin segu mõned minutid . Segu värvus tumepruuniks ning vastu valgust vaadates oli näha ülipeent sadet (sadet oli veidi keeruline näha, kuna NaOH liigse lisamise tõttu oli kogu lahus suhteliselt tume).
Järeldus:
Positiivne katse tulemus näitas, et munavalgus esineb tsüsteiini.
1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
Trikloroäädikhape (TKÄ) on valke denatureeriv ja väljasadestav regent, kuid see ei sadesta peptiide, mille molekullmass on alla 10000. TKÄ-d saab asutada valkude eraldamiseks madalmolekulaarsetest lämmastikühenditest.
Töö käik:
Valsin katseklaasi 1ml munavalgu lahust ja lisasin 2 tilka CCl3COOH lahust. Loksutasin ning selle tulemusena tekkis valge peen kolloidne sade.
Järeldus:
Kuna TKÄ toimel tekkis sade võib järeldada, et munavalgus sisaldub peptiide, mille molekulmass on üle 10000.
1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
Naturaalsete soolade (NaCl; (NH4) 2SO4 ; MgSO4) kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni ja väljasadestumist, seda protsessi nimetatakse väljasoolastumiseks. Sadestumist mõjutavad valgu hüdrofiilsus/ -foobsus, laeng molekulmass jne.. Globuliinid sadestuvad (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinid aga küllastunud lahuses.
Töö käik:
Katseklaasis olevale 2ml munavalgu lahusele lisasin u. 2ml (NH4)2SO4 küllastunud lahust ning jätsin statiivile seisma 5 minutiks. Tekkinud sade, mis teooria kohaselt on globuliinide oma, eraldasin filtrimise teel (filterpaber+ lehter ). Filtreerisin umbes poole lahusest. Saadud filtraadile lisasin vähehaaval ja pidevalt loksutades (NH4)2SO4 kuni küllastumise saabumiseni, ehk kuni sool enam ei lahustunud. Tekkis sade, teooria kohaselt albumiinide sade.
Järeldus:
Tekkinud sademe hulga põhjal võin järeldada, et ligikaudne albumiinide ja globuliinide sue munavalgus on: 30% globuliine ja 70% albumiine.
1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kõrgel temperatuuril denatureerivad kõik valgud pöördumatult, kuna ruumilises struktuuris olevad nõrgad sidemed katkevad. Tavaliselt kaasneb sellega ka valgu väljasadestumine. Kui aga pH väärtus erineb valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest tunduvalt, ei pruugi sadestumist toimuda. Valgu isoelektriline punkt on punkt, mis näitab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne ehk laeng on võrdne 0-ga. Kui aga pI ja keskkonna pH väärtused on olulise erinevusega omandavad kõik molekulid ühesuguse laengu, valk-valk interaktsioonid lakkavad - sadestumist ei toimu.
Töö käik:
Kahte katseklaasi valasin 2ml munavalgu lahust, ühte lisasin veel 1ml konts. äädikhapet ( etaanhape ). Kuumutasin mõlemat katseklaasi vesivannis. Happeta katseklaasis tekkis valge sade.
Järeldus:
Sade tekkis katseklaasis, kus sisaldus ainult munavalgu lahus, kuna äädikhape muutis teises katseklaasis keskkonnas pH-d nii palju, et valgu molekulid enam ei agregeerinud.
1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega
Veega segunevad orgaanilised solvendid (etanool, atsetoon ) kutsuvad esile valgumolekulides aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise välispinnale. Toimub dehüdratiseerumine, valk sadestub välja. Kui lisada solventi ettevaatlikult pidevalt loksutades toimub pöörduv denaturatsioon e. sade lahustub uuesti kui veega sadesti kontsentratsiooni vähendada. Kui aga lisada solventi liiga kiiresti või suures koguses on tekkiv denaturatsioon pöördumatu.
Töö käik:
Valasin katseklaasi 2ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja loksutades lisasin orgaanilist solventi kuni tekkis sade (lahus muutus häguseks). Siis lisasim katseklaasi vett, sade ei lahustunud enam.
Järeldus:
Vee lisamisel sade enam ei lahustunud, tegemist oli pöördumatu denaturatsiooniga. Tõenäoliselt lisasin solventi liiga palju või kiiresti suuremas koguses põhjustades kõrge lokaalse kontsentratsiooni.

1.2 Süsivesikud

1.2.1 Molisch’I test
Testi loetakse süsivesikute analüüsi põhitestiks kuna positiivset reakstiooni annad mahust (pikkusest) olenemata kõik sahhariidid , nii mono -, oligo- kui polüsahhariidid. Ka glükoproteiinid ja nukleiinhapped annavad positiivse reaktsiooni, kuna keskkonna tugeva happelisuse tõttu tekib pikapeale monosahhariidide vabanemine. Suhkrud dehüdreeruvad väävelhappe toimel ning moodustavad , kas furaale või 5-hüdroksümetüülfuraale, edasi reageerivad need α-naftooliga, moodustub violetne (purpur) kiht lahuse ja happe piirile.
Töö käik:
Valasin ühte katseklaasi 2ml tärklise lahust ja teise 2ml laktoosi lahust. Lisasin mõlemasse katseklaasi 5 tilka Molisch’i reaktiivi (α-naftooli lahus alkoholis), loksutan katseklaase. Lisasin katseklaasi kaldus hoides mõlemasse klaasi 1ml väävelhapet. NÜÜD EI TOHI ENAM LOKSUTADA (hape ja proov ei tohi seguneda). Tärklisega katseklaasis muutus segu alumine lahuse osa roheliseks ning piirpinnal oli purpurjas kiht. Laktosiga klaasis oli alumine osa samuti roheline kuid piirpind oli lillakam.
Järeldus:
Selle katsega sai tõestatud, et tärklis ja laktoos on süsivesikud (sahhariidid)
1.2.2 Osasoonide saamine
Osasoonid, süsivesikute derivaadid, tekivad redutseeriva suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Monoosidega kõrvuti moodustavad osasoone ka taanavad oligosahhariidid . Osasoonid kristalluvad lahusest välja. Osasoonide järgi saab eristada sarnaseid suhkruid, mille stereostruktuurid erinevad ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni tõttu. Osasoonide moodustumine on kahe etapiline:

Reaktsioon C-1 paikneva aldehüüdrühma laudu ja formeerub hüdrasoon C-1 positsioonis

C-2 asendis oleva hüdroksüülrühma oksüdeerumine karbonüüliks ja C-2 asendis hüdrasooni formerumine.
Töö käik:
Ühte katseklaasi valasin 2ml glükoosi lahust, teise katseklaasi valasin 2ml arabinoosi lahust. Lisan mõlemasse katseklaasi u. 0,1 g tahet fenüülhüdrasiini ja u. 0,2 g kristallilist naatriumatsetaati, loksutasin kuni takhed ained lahustusid. Kuumutasin mõlemat segu u. 40min vesivannis. Seejärel asetasin katseklaasid jää sisse jahtuma. Katseklaasidesse moodustusid kollased kristallid (ka lahus ise oli kollakas ). Vaatlesin tekkinud osasoone mikroskoobi all.
Järeldused:
Vaadeldud osasoonide struktuurid olid järgmised: Glükoosi osasoonid
Arabinoosi osasoonid
1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon
Taandavate suhkrute molemulis olev aldehüülrühm taandab mitmete metallise soolasid. Amoniakaalsest hõbenitraadi lahusest sadestub metalliline hõbe katseklaasi pinnale, moodustades nö „hõbepeegli“. Tolleni reaktiivis on aktiivseks komponendiks MgNO3 ja NH4 põhjal tekkiv diamiinhõbe(I).
Töö käik:
Pestud ja kuiva katseklaasi valasin 1ml AgNO3 lahust, lisasin 0,5 ml konts NH4OH lahust ja loksutasin. Siis lisasin u. 1ml glükoosi lahust, loksutasin segu ja kuumutasin vesivannis. Mul ei tulnud positiivset reaktsiooni (hõbe ei sadestunud katseklaasi seintele).
Järeldused:
Katse ebaõnnestumise põhjuseks võis olla liigne glükoosi lisamine, mis vähendas segu aluselisust, või katseklaasi loksumine kuumutamisel (vesi kees ja õhumullid liiguatsid katseklaasi). Mul tekkis kogu lahusesse hall sade.
1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
Taandavate suhkrute määramisel on levimuimaks reaktiiviks leeliseline vask(II)tartraatkompleks (Fehlngi reaktiiv ), see saadakse Fehling I (CuSO4 vesilahus) ja Fehling II (leeliseline K, Na- tartraat ) lahuste kokku segamisel. Tekkiv kompleks reageerib aldooside või ketoosidega. Vaba alehüüd või ketorühma mõjul taandub vask, andes vask(I)oksiidi, punane sade. Suhkur aga oksüdeerub happeks. Sahharoos niisama Fehlingi reaktiiviga ei reageeri (pole taandav suhkur), Sahharoosi hüdrolüüsi kiirendatakse kas ensümaatiliselt või happe toimel kõrgel temperatuuril. Saharoosi hürdolüüsi protsessi nimetatakseinversiooniks ja tekkivat segu invertsuhkruks.
Töö käik:
Valasin kahte katseklaasi 1ml sahharoosi lahust, ühte lisasin 1 tilk konts. HCl. Loksutasin ja kuumutasin mõlemat lahust u. 5min vesivannis (temp u 80 kraadi Celsiust). Siis lisasin mõlemasse klaasi 1ml Fehling I ja 1ml Fehling II lahust ja loksutasin veel kord. Lahus muutus mõlemas klaasis tugevaks siniseks . Soojendasin katseklaase veel, ning HCl-ga katseklaasis tekkis punane sade.
Järeldus:
Punane sade tekkis selles katseklaasis , kuhu oli sahharoosi hüdrolüüsi kiirendamiseks lisatud konts. HCl. Teises katseklaasis oli segatud lihtsalt sahharoos Fehlingi reaktiiviga ning seal vastavat reaktsiooni ei toimunud,kuna sahharoos ei ole taandav suhkur.
1.2.5 Barfoed’ reaktioon
Sahhariidide reaktsioon Barfoed’ reaktiiviga võimaldab eristada taanavaid monosahhariide oligosahhariidisdest ( vask(II)atsetadi lahus äädikhappes). Seda seetõttu, et nõrgas happelises keskkonnas taandab vaske ainult monosahhariid . Reaktsiooni tulemus on punane vask(I)oksiidi sade.
Töö käik:
Ühte katseklaasi valasin 1ml fruktoosi lahust ja teise katseklaasi 1 ml laktoosi lahust. Mõlemasse klaasi lisasin 3ml Barfoed’ reaktiivi. Segasin ja hoidsin 4 miutit veevannil. Fruktoosiga katseklaasis tekkis punane sade, teises katseklaasis sadet ei tekkinud.
Järelused:
Siit katsest saab järeldada, et fruktoos on monosahhariid, aga laktoos on oligosahhariid.
1.2.6 Selivanoff ’i reaktsioon
Tugevate mineraalhapete juuresolekul suhruid kuumutades moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal ja heksoosidet 5-hüdroksümetüülfurfuraal. Ühendid reageerivad mitmealuselist fenoolidega, moodustades värvilisi omplekse. Seda kasutatakse suhkrute kvantitatiivseks määramiseks. Üks selline reaktiiv on Selinoff’i reaktiiv (soolhape+kondenseeriva agendina benseen -1,3-diool+katalüsaatorina FeCl3) Reaktisooni värvus on punakaspruun kuni tumepruun. Reaktsioon toimub kiiremini ketoosidega.
Töö käik:
Valasin ühte katseklaasi 1ml fruktoosi lahust ja teise 1ml glükoosi lahust. Lisasin mõlemasse Selivanoff’i reatiivi ja loksutasin. Soojendasin 5 minutit vesivannil. Fruktoosiga katseklaasis värvus lahus punakaks (u 4 min). Glükoosiga lahus on 5. minutiks kergelt roosakas
Järeldused:
Fruktoosiga tomius värvuse muutumine palju kiiremini ja värus oli intensiivsem. Järelikult on Fruktoos ketoos ja Glükoos aldoos.
1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga
Tärklistele on iseloomulik mooustada joodiga intensiivne lillakas -sinineid komplekse. See on tingitud polüsahhariidid ahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Tekkinud komplseks laguneb väga kõrgel temperatuuril.
Töö käik:

Valasin katseklaasi 4 ml tärklise lahust ja lisasin 1ml joodilahust.Lahus värvus siniseks. Loksutasin segu ja kuumutasin.Lahus muutus värvituks. Siis jahutasin jäävannis katseklaasi alumise osa ning seal taastus eelneval olnud sinine värvus.

Vaatlesin mikrosboobi all maisitärklise ja kartulitärklise proove.
maisitärklis
kartulitärklis
Järeldused:
Katses selgus, et tärklise kompleks joodiga ei ole püsiv kuumusele (pöörduv reaktsioon)