Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Biokeemia praktikum
3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil

... ...
Juhendaja : Malle Kreen
2015
Sissejuhatus
Selles praktikumis sooritasin töö teemal glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil.
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoois oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel .
GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerides FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaasrses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
Meetodi järgmises etapis kasutatakse rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor :H2O2-oksüdoreduktaas. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt , siis saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid erinevaid orgaanilisi ühendeid. Lisaks orgaanilistele ühenditele võib substraadina kasutada K4[Fe(CN)6] (kollane veresool ). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt vesinikperoksiid redutseerub veeks . Tekkiv K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeriv lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures.
Töö käik: Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, milleks mina kasutasin mett . Selleks kasutasin tööreaktiivi, mis sisaldas eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi ja kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6].
Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine
Uuritava lahusena , milles glükoosi kontsentratsiooni määrama hakkasin, kasutasin mina mee tõmmist. Selleks kaalusin analüütilistel kaaludel purgist Mesi I 115,0 mg mett ja viisin kadudeta 200 ml mahuga mõõtekolbi. Seda tegin kuuma destilleeritud veega, mida lisasin väikeste portsionitena 3 korda kaaluklaasi, segasin klaasi sisu väikese metallpulgaga ja valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtekolbi. Ca 2/3 kolvi mahust täitsin kuuma destilleeritud veega ja hoidsin kolbi veel ~20 minutit kuumas vesivannis. Seejärel jahutasin lahuse toatemperatuurini ning täitsin kolbi külma destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, sulesin korgiga ja ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks loksutasin läbi.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtusin glükoosi standardlahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust. Selleks kasutasin samm-sammult lahjendamist:
Nagu skeemilt näha, toimisin järgnevalt: võtsin 2,5 ml standardlahust ning lisasin 7,5 ml destilleeritud vett ja loksutasin hoolikalt läbi. Sain lahuse kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml. Seejärel võtsin saadud lahusest 5 ml järgmisesse katseklaasi ning lisasin juurde 5 ml destilleeritud vett ja loksutasin. Sain lahuse kontsentratsiooniga 0,125 mg/ml. Viimaks võtsin saadud teisest lahjendusest 5 ml lahust ning lisasin 5 ml destilleeritud vett, loksutasin. Kolmanda lahjenduse sain kontsentratsiooniga 0,062 mg/ml.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsiooni tööreaktiiviga viisin läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks asetasin katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ning nummerdasin need. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett, katseklaasidesse nr 2 ja 3 1 ml mee tõmmist ning katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust (mida olin eelnevalt valmistanud). Seejärel lisasin igasse katseklaasi 3 ml tööreaktiivi, loksutasin ning hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril.
Kaliibrismisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Proov
Optiline tihedus
Optiline tihedus kontrollproovita
Destilleeritud vesi (kontrollproov)
0,0832
-
Mee tõmmis 1
0,1714
0,0882
Mee tõmmis 2
0,1710
0,0878
Glükoosilahuse lahjendus I
0,2298
0,1466
Glükoosilahuse lahjendus II
0,1530
0,0698
Glükoosilahuse lahjendus III
0,1233
0,0401
Kaliibrimisgraafik :
Arvutan keskmise optilise tiheduse mee tõmmises:
Loen graafikult glükoosi kontsentratsiooni mee tõmmises: ~0,15 mg/ml.
Glükoosi sisaldus massiprotsentides:
C – glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kaliibrimissirge järgi (mg/ml)
V1 – uuritava lahuse üldmaht (ml)
L – lahjendustegur
10-3 – tegur üleminekuks grammidele
V2 – värvusreaktsiooni võetud uuritava lahuse maht (ml)
G – uuritava materjali (mesi) kaalutis (g)
W – uuritava materjali niiskusesisaldus massiosana (leitakse teatmekirjandusest)
Keskmine niiskusesisaldus Eesti mees on ~17,0% ( http://2013-2016.mesindusprogramm.eu/sites/default/files/3_meekvaliteedi_aruanne_01.03.14-31.08.14.pdf )
Glükoosi sisaldus mee tõmmises massiprotsentides:
Kirjandusest leitud andmete põhjal on Eesti mee glükoosisisaldus massiprotsentides 38,9%. (Andmed leidsin samast meekvaliteedi aruandest, kust leidsin ka keskmise niiskusesisalduse.)
Kuigi minu tulemus ei vasta täpselt kirjanduse andmetele, arvan, et võin lugeda oma katse õnnestunuks, sest nii niiskusesisaldus (mida kasutasin glükoosisisalduse arvutamisel) ning ka glükoosisisaldus on erinevatest kohtadest pärit metes erinevad (kirjanduses on antud Eesti mee keskmine niiskuse- ja glükoosisisaldus).