3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil - Biokeemia labori protokoll (0)

Tallinna Tehnikaülikool
3.3 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil

Biokeemia labori protokoll

2011

Töö teoreetilised alused

Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel . Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β, D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juureolekul. GOx katalüüsib glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel. GOx on liitvalk e flavoproteiin, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniinnukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina.
FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi, mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas.
Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide(elektronide doonorite) oksüdeerumist kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.
Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt ,siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt.
Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
Värvusetu Värviline
Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool . POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.
Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II).

Katse käik

Tööreaktiiv

Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga.

Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine

Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul sidrunimahl.
Sidrunimahlast tuli valmistada 25-kordne lahjendus. Selleks pipeteerisin gradueeritud katseklaasi 1 mL sidrunimahla ja ülejäänud 24 mL täitsin destilleeritud veega.

Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks

Glükoosi standardlahus sisaldab 1,0 mg/mL glükoosi. Standardlahusest valmistasin 3 lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL ja 0,062 mg/mL.
Lahjendamisel lähtsuin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja lahjendatud lahuse lõpmahus sisaldub võrdne ainehulk .
Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL.
Lahjendatud glükoosilahuste tegemiseks võtsin kolm puhast ja kuiva kaliibritud katseklaasi. Valmistasin standardlahusest 10 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Selleks pipeteerisin I katseklaasi 2,5 mL standardlahust ja täitsin destilleeritud veega kuni 10 mL-ni. Loksutasin. Lahjendasin saadud lahust kaks korda (II katseklaas ) ning saadud teist lahust veel omakorda kaks korda (III katseklaas). Loksutasin.

Värvusreaktsiooni läbiviimine

Nummerdasin 6 puhast ja kuiva katseklaasi, asetasin need statiivi.
Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 mL destileeritud vett. See oli kontroll- ehk 0- proov , mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni.
Katseklaasidesse nr 2 ja nr 3 pipeteerisin kummasegi 1 mL uuritavat lahust ehk sidrunimahla (2 paralleelproovi)
Katseklaasi nr 4 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL.
Katseklaasi nr 5 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/mL ja katseklaasi nr 6 1 mL glükoosilahust, mille kontsentratsioon oli 0,062 mg/mL.
Kõigisse kuude katseklaasi pipeteerisin 3 mL tööreaktiivi ja loksutasin, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni. Hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril.
Mõõtsin spektrofotomeetriga lainepikkusel 410 nm lahuste optiliste tiheduste väärtused. Võrdluslahusena kasutasin destilleeritud vett.
Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu, siis korrigeerisin kõikide glükoosi sisaldavate lahuste optilise tiheduse väärtuseid.
Proov
Optiline tihedus
Katseklaas nr 1 (Kontrollproov/0-proov)
0,0135 ABS
Katseklaas nr 2 (I paralleelproov)
0, 1283 - 0,0135 = 0,1148 ABS
Katseklaas nr 3 (II paralleelproov)
0,1294 - 0,0135 = 0, 1159 ABS
Katseklaas nr 4 (C4 = 0,25 mg/mL)
0,1493 - 0,0135 = 0,1358 ABS
Katseklaas nr 5 (C5 = 0,125 mg/mL)
0,0627 - 0,0135 = 0,0492 ABS
Katseklaas nr 6 (C6 = 0,062 mg/mL)
0,0226 - 0,0135 = 0,0091 ABS
Tabel 1. Katseandmed

Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine

Kaliibrimisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosikontsentratsiooniga proovide absorptisooni väärtuste alusel. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust.
Kasutasin korrigeeritud absorptsiooni väärtuseid.
Joonis 1. Kaliibrimisgraafik
Paralleelproovide keskmine optiline tihedus:
Kaliibrimissgraafikult leidsin, et sellele optilisele tihedusele vastab glükoosi kontsentratsioon:
Cglükoos/sidrunimahl = 0,2206 mg/mL (25 korda lahjendatud lahuses)
Tundmatu proovi glükoosisisaldus on seega:
Glükoosisisalduse massiprotsentides naturaalse mahla suhtes arvutasin valemiga:
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /mL)
L – mahla lahjendustegur
d – mahla tihedus (g /cm3) d = 1,031328 g/cm3

Järeldus

Katse tulemusena sain, et ühes 1 g sidrunimahlas sisaldus 5,515 mg glükoosi, mis on 0,57 %.
Kirjanduse andmetel sisaldub 100 g-s sidrunimahlas 0,5 g glükoosi ehk glükoosisisaldus on 0,5%. Seega suurujärk on õige.
Kaliibrimisgraafiku punktid tulid ilusti ühel sirgel asetsevatena, kõrvalekalle on väga pisike, kuid minu kaliibrimisgraafik ei läbi koordinaatide alguspunkti nagu ta peaks. Ilmselt olen katse käigus natuke mõõdetud kogustega eksinud , kasutasin nimelt pipeteeritud 2,5 mL sidrunimahla lahjendamiseks 10 mL-ni gradueeritud katseklaasi mõõtu, kuid see ei pruukinud olla nii täpne, kui pipetiga mõõtmisel oleks olnud.