Karotenoidid ja lipiidid - labori protokoll (3)

Tallinna tehnikaülikool
Matemaatika-loodusteaduskond
Bioorgaanilise keemia õppetool
2.2.Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
1.3. Lipiidide reaktsioonid
Kaisa Rahuoja
093421 KATB41
2.2. Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine - apelsini koor
Töö eesmärk: Karotenoidide hulka kuulub ligi 600 erinevat ühendit, töö käigus tuleb kindlaks teha, millised neist antud töös esinevad ning kui palju karotenoide kvantitatiivselt proovis leidub.
Töö käik: Peenestatakse taimne materjal, millest soovitakse proovi võtta. Peenestatud materjalist kaalutakse vastavalt labori juhendaja soovitusele 0,5-2g proovi. (antud töös 0,56g apelsinikoort). Seejärel peenestatakse proov uhmris nuiaga. Peenestamise kiirendamiseks lisatakse puhast kvartsliiva ning niiskuse eemaldamiseks proovist lisatakse veevaba Na2SO4 senikaua , kuni proovist on kogu vesi välja saadud.
Järgnevalt lahustatakse karotenoidid segust välja sobiva orgaanilise lahustiga (petrooleeter). Kogusin segust karotenoidi de lahust ja filtrisin selle kuiva 25 ml mõõtsilindrisse. Ekstraheerimine kestis seni, kuni petrooleetri lahus muutus värvituks. Ekstraheerimine toimub tõmbekapi all.
Spektrofotomeetriga analüüsitakse saadud lahust, et teha kindlaks, missuguseid karotenoide lahus sisaldab. Saadud andmete põhjal arvutatakse välja ka karotenoidide kvantitatiivsed kogused lahuses.
Katseandmed
Lahuse spekteranalüüsil on näha kolme tippu e. maksimumkohta.
Lahuse lainepikkus , nm
lahuse neelduvus
neoksantiini lainepikkus, nm
E1cm1%
464
0,4886
467
3110
435
0,5632
439
2270
414,5
0,4248
415
1550
Katseandmeid analüüsides leidsin, et apelsini koores leidub neoksantiini. Kirjandusallikad kinnitavad katse tulemust.
Karotenoidide sisaldude kvantitatiivne analüüs
Arvutuste tegemisel kasutan kõige suuremale lainepikkusele vastavat neelduvuse väärtust. Teatmeteosest leidsin lükopeeni ekstinktsioonikoefitsendi (E1cm1%) väärtused
K = 0,4886× 23,5× 0,65×103/2270×0,56 = 5,87mg %
Lipiidide reaktsioonid
1.Rasvapleki proov
Uurisin kahte erinevat proovi, milelst üks sisaldas lipiide ja teine mitte. (samad proovid , mida kasutan hiljem ka akroleiintestis) 1 g-le tahkele ainele lisasin 0.5 ml orgaanilist lahustit atsetooni . Peale hoolikat loksutamist lasin segul settida. Seejärel tilgutasin mõlemat lahust klaaspulga abil filterbaberitele. Proov nr 1. Jättis paberile rasvapleki sam al ajal kui 2.proovist tekkinud proov oli läbipaistev. Seega teginjärelduse, et lipiide sisaldub 1. proovis. Õppejõuga kontsulteerides selgus aga, et tegelikult peaks lipiide sisaldama 2. mitte 1. proov. Kuna proove võeti katseklaasi sama spaatli erinevate otstega, siis ilmselt oli keegi spaatli otsad segamini ajanud ja proovi rikkunud.
2.Emulsioonitest
Valasin kahte kuiva katseklaasi 2ml 96% etanooli ja lisasin 2 ml kahte erinevat lahust, millest üks sisaldas lipiide ja teine mitte. Loksutasin mõlemat katseklaasi hoolikalt. Seejärel lisasin 4ml destilleeritud vett. 1. Proovi sisaldanud lahus muutus häguseks. See on lipiidide olemasolu kinnituseks .
3.Akroleiiniproov
Lisasin kahte katseklaasi 1g NaHSO4 ja lisasin kummalegi mõne tilga erinevatest akroleiiniproovidest. Kuumutasin segusid gaasipõleti leegil. Ühes katseklaasis olev segu muutus tumedaks (proov 2), moodustus akroleiin, teises mitte (proov 1) . Järelikult leidus esimeses proovis glütserooli, teises aga mitte.
4.Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Lisasin kolme katseklaasi erinevat lipiidi lahust
1.steariinhape
2.või (loomne rasv )
3.oliivõli (taimne rasv)
Igale lahusele lisasin ~8 tilka broomilahust. Broomile iseloomulik pruunikas värvus kadus täielikult oliivõli lahuses. Ka või lahuse värv muutus heledamaks, hiljem kadus broomi värvus täielikult. Steariinhappelahus oli broomile iseloomulikku pruunikat värvi. Broom liitub küllastumata ühendite kaksiksidemetele. Seega võib järeldada, et oliivõlis on palju küllastumatust, võis on ka kaksidemeid, aga steariinhappes mitte.
CH3(CH2)nCH=CH(CH2)mCOOH +Br2 --> CH3(CH2)nCHBr-CHBr(CH2)mCOOH
steariinhape
5. Liebermann -Burchard´i kolesterooli määramise test
Kolme katseklaasi valasin erineva lipiidi lahust.
1.kolesterool
2.oliivõli
3.või
Igasse katseklaasi lisasin 6 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4 tilka väävelhapet. Loksutasin hoolega igat kateklaasi. Kolesterooli sisadav lahus muutus siniseks, teiste värvus ei muutunud. Kolesterool reageerib väävelhappelises keskkonnas äädikhappe anhüdriidiga moodustades kolesterooli polüeensete derivaatide segu. Katse tõestab, et oliivõlis ja katses kasutataud võis kolesterooli ei ole.