Laboratoorne töö 3.4 (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
KEEMIAINSTITUUT
Bioorgaanilise keemia õppetool
YKL3312 Biokeemia praktikum
Laboratoorne töö
3. Biokatalüüs
3.4 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Tallinn 2010
3.BIOKATALÜÜS
3.4 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE
TÖÖ TEOREETILISED ALUSED
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on arvukas rühm ensüüme, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooni tulemuseks on erineva molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped . Proteolüütilise ensüümi aktiivsus avaldatakse hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Kasutatakse sõltuvalt uuritava proteaasi omapärast vastavaid substraate ja talle sobiva Ph-ga puhvreid.
Selles töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini . Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestatakse TKÄ-ga, mis ühtlasi peatab ka ensüümi. Seejärel määratakse mitte sadestuvad hüdrolüüsi produktid spektrofotomeetriga.
Töö käik
1. Valmistasin uuritava proteaasi Savinase lahuse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris. Kaalusin analüütilistel kaaludel ensüümi 0,006 g. Viisin selle kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Lisasin väikse koguse puhvelahust ja loksutasin, kuni ensüüm lahustus. Seejärel lisasin puhverlahust juurde, nii, et seda oli kokku 5ml.
2. Võtsin 50ml mahuga suurema katseklaasi ja pipteerisin sinna 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin vesitermostaati 30 juurde 10 minutiks seisma.
3. Võtsin neli katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipteerisin igaühte 3ml 5%-list TKÄ lahust.
4. Kui kaseiini lahus oli soojenenud, alustasin hüdrolüüsi. Pipteerisin kaseiinile juurde 1ml uuritava proteaasi lahust, loksutasin ja võtsin 3ml proovi. Esimese proovi võtmise hetkel vaatasin ka kella. Seejärel võtsin iga 5 minuti järel taas 3ml reaktsioonisegu kuni neid oli kokku neli. Reaktsioonisegu pipteerisin katseklaasi, kus oli TKÄ lahus ja loksutasin ja nii neli korda.
5. Lasin proovidel seista ja seejärel filtrisin kõik neli proovi puhastesse katseklaasidesse.
6. Määrasin spektromeetril nende optilised tihedused .
Proovide optilised tihedused:
= 0,386 A
= 0,561 A
= 0,853 A
= 1,156 A
Aromaatset tuuma sisaldavad aminohaooed on tänu 280nm piirkonnas paiknevate neeldumismaksimumide spektrofotomeetriliselt detekteeritavad. Hüdrolüüsi produktide sisaldus avaldatakse türosiini mikromoolidena.
Õppejõult saadud kaliibrimisgraafiku alusel sain türosiini kontsentratsiooniks:
=0,06 mg/ml 0s
=0,09 mg/ml 300s
=0,1370mg/ml 600s
=0,1840mg/ml 900s
Arvutan preparaadi proteolüütilise aktiivsuse vastavalt järgmisele valemile:
Kus:
- türosiini kontsentratsiooni muutus mg/ml: 0,1840-0,098=0,086mg/ml
- hüdrolüüsi kestvus s: 900-300=600s
- hüdrolüüsisegu üldmaht ml: 26ml
2- TKÄ lahusest tingitud lahjendus
- ensüümilahuse üldmaht ml: 5ml
- ensüümi maht hüdrolüüsisegus ml: 1ml
g- proteaasi kaalutis: 0,006g
181- türosiini molekulmass.
Pannes arvud valmeisse saan:
μkat/g
Kokkuvõte: 30juures on savinase aktiivsus 34,32 μkat/g see tähendab, et 1s jooksul hüdrolüüsiti 34,32 μmooli peptiidsidemeid.