GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia instituut
BIOKATALÜÜS
3.3. GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Juhendaja : Tiina Randla
Töö teoreetilised alused
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi ja peroksüdaasi kasutamisel . Gox-i süstemaatiline nimetus
näitab, et ta katalüüsib , D- glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel.
FAD seab glükoosi molekuli kaks vesiniku aatomit, redutseerib FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldab lahustunult reaktsioonikeskkonnas.
Järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside esindajat, mille nimetus on doonor : H202-oksüdoreduktaas.
Kui kasutatakse substraadi, mille oksüdeerimisel tekib värviline produkt , siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektofotomeetriliselt. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine:
Taandatud substraat + H2O2
Oksüdeeritud substaat + 2 H2O
POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate.
Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.
2 Fe2+ +H2O2 + 2H+
2 Fe 3+ +2 H2O
Töö käik
Tööreaktiiv
Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on olulisene koht tööreaktiivil, mis sisaldab Gox, Pox, kaaliumheksatsüanoferraati (II) ja fosfaatpuhvrit pH 6. Tööreaktiiv oli valmistatud praktikumi juhendaja poolt.
Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine
Minu uuritavaks lahuseks oli mesi , mida ma kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0, 1199 g ning viisin selle kvantitatiivselt 200 ml mahuga mõõtekolbi. Selleks kuumutasin destilleeritud vett ning lisasin väikeses koguses vett kaaluklaasi, segasin lahust klaaspuga ning valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtkolbi. Seda kordasin veel 3 korda. Järgnevalt täitsin mõõtkolvi
mahus destilleeritud veega ning loksutasin lahust kontsentratsioonide ühtlustumiseks. Ootasin kuni lahus oli jahtunud ning lisasin destilleeritud vett kuni kriipsuni. Lahuse pH väärtust ei pidanud mõõtma.
Glükoosilahuste valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks
Glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb esmalt koostada kalibreerimisgraafik lainepikkusel = 410 nm. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoos 1,0 mg/ml. Selleks valmistasin standardlahusest kolm lahjemat glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml.
Lahjenduste valmistamiseks võtsin 3 puhast katseklaasi. Esimesse katseklaasi pipeteerisin 2,5 ml glükoosi standardlahust ning 7,5 ml destilleeritud vett ning loksutasin hoolikalt ühtlase kontsentratsiooni saamiseks. Selle tulemusel sain 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga lahuse. Teise katseklaasi pipeteerisin 5 ml 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga lahust ning 5 ml destilleeritud vett, mille tulemusel sain 0,125 mg/ml kontsentratsiooniga lahuse. Loksutasin lahust hoolikalt. Kolmandasse katseklaasi pipeteerisin teist katse klaasist 5 ml 0,125 mg/ml kontsentratsiooniga lahust ning 5 ml destilleeritud vett, mille tulemusel sain 0,062 mg/ml kontsentratsiooniga lahuse ning loksutasin katseklaasi hoolikalt.
Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsiooniks tööreaktiiviga pidin võtma 6 kuiva ning puhast katseklaasi ning need nummerdama. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml destilleeritud vett, mis oli kontrollkatseks e 0-prooviks. Uuritava lahusega tuli teha kaks parallelkatset ehk katseklaasi nr 2 ja 3 pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml uuritavat lahust. Katseklaasi nr 4, 5 ja 6 pipeteerisin automaatpipetiga 1 ml eelnevalt valmistatud 3 erineva kontsentratsiooniga kontrolllahust.
Igasse katseklaasi pipeteerisin 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin koheselt, et saavutada ühtlast kontsentratsiooni ning fikseerisin reaktsiooni alguse aja ning ootasin 20 minutit, et tekiks reaktsioon , mille tulemusel glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva K-heksatsüanoferraat (III) toimel kollaseks.
Pärast 20 minuti möödumist mõõtsin lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused.
Katsetulemused
Katse-klaas
Mõõdetud optilise tiheduse väärtus
Korrigeeritud optilise tiheduse väärtus
1.
0,008
0,000
2.
0,030
0,022
3.
0,030
0,022
4.
0,040
0,032
5.
0,024
0,016
6.
0,016
0,008
Katseklaas nr 1. – destilleeritud vesi (kontrollproov) + tööreaktiiv
Katseklaas nr 2. – mee lahus + tööreaktiiv 2 paralleelproovi
Katseklaas nr 3. – mee lahus + tööreaktiiv
Katseklaas nr 4. – glükoosilahus kontsentatsiooniga 0,25 mg/ml + tööreaktiiv
Katseklaas nr 5. – glükoosilahus kontsentratsiooniga 0,125 mg/ml + tööreaktiiv
Katseklaas nr 6. – glükoosilahus kontsentratsiooniga 0,062 mg/ml + tööreaktiiv
Kalibreerimisgraafik glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks
Glükoosisisaldus massiprotsentides (X, %)
X=
C- glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kalibreerimisgraafiku järgi
V1 – uuritava lahuse üldmaht
L – lahjendustegur
10-3 – tegur üleminekuks grammidele
V2 – värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetud uuritava lahuse maht (ml)
G – uuritava materjali kaalutis (g)
W- uuritava materjali niiskusesisaldus massiosana
Minu andmed
C= 0,17 mg/ml
V1 = 200 ml
L= 1 /2/
V2 = 1 ml
G = 0,1199 g
W= 0,17
X=
= 34,17 %
Kirjanduse andmete kohaselt on mees enamsti glükoos ja fruktoos , millest glükoosisisaldus on umbes 28-35 % /1/. Minu katsetulemusel saadud glükoosisisaldus sobib vahemikku.
Kasutatud kirjandus
1. Interneti materjal:
www.propolis.ee
2. Sõukand, Ü., Aunap, A. Eestis kogutud meeproovide analüüs mee kvaliteedinäitajate ja jääkainete määramiseks perioodil 01.09.2005 – 31.08.2006 Tallinn, 2006