Biokeemia protokoll. Valgud ja süsivesikud (0)

Töö teoreetilised alused
Et osata hinnata uuritava proovi ainelist sisaldust, on suuresti abiks erinevad kvalitatiivsed reaktsioonid. Kvalitatiivsed reaktsioonid on pikema aja jooksul välja kujunenud tõhusaks meetodiks tunnistatud laboratoorsed katsed ja nendele iseloomulike reaktsioonitulemuste põhjal saab tuvastada konkreetse ühendi/ ühendite rühma/ keemilise elemendi ja/ või funktsionaalse rühma olemasolu lahuses. Selleks võib olla: iseloomuliku värvusreaktsiooni teke; sademe või hägu moodustumine; gaasi eraldumine; muud silmale nähtavad muudatused.
Antud töös tulevad vaatluse alla valkude ja süsivesikute kvalitatiivsed meetodid. Valgu puhul mängib tähtsat rolli tema aminohappeline koosseis ja järjestus, lisaks valgu ruumiline struktuur. Siin puhul on abiks värvusreaktsioonide tekitamine, väljasadestamine lahusest reagentide või temperatuuri toimel ( termiline denaturatsioon), ja väljasoolastamine erinevate valgufraktsioonide lahutamiseks. Süsivesikute kvalitatiivsed reaktsioonid põhinevad enamuses karbonüülrühma esinemises molekulis. Erinevad reaktsioonid annavad iga süsivesiku puhul aga erineva produkti ning siis saab tõhusalt eristada lähtesuhkruid üksteisest. Ka saab kindla süsivesiku tuvastada osasooni kristallstruktuuri põhjal, mis saadakse osasoonide moodustumise reaktsiooni abil.
Töö käik
Valgud
1.1.1. Biureedireaktsioon
~1 ml munavalgu lahusele lisasin 1 ml 10%-list NaOH lahust ja 2 tilka 1%-list CuSO4 lahust. Sain siniste tükikestega läbipaistevlilla vedeliku. Loksutades tuli lilla toon rohkem välja, tükid olid väiksemad ja hõredalt. Paar korda panin katseklaasi keeva vee sisse, mõne hetke seal hoides - tulemuseks lilla lahus, vähe oli pisikesi tükke (sadet). Edasisel soojendamisel lilla värvus muutus tuhmimaks. Lõpuks sain musta-kollaka lahuse, mille sees paistis natuke pruunikat värvi tükke.
Järeldus
Leeliselises keskkonnas moodustas munavalk Cu2+ ioonidega lilla värvusega biureetkompleksi. Kui lahust järgnevalt segasin ja soojendasin, siis valguahelad katkesid, mistõttu lühikesed peptiidahelad, olles vaseioonidega kokkupuutes, andsid uue värvuse- musta-kollaka.
1.1.2. Ksantoproteiinreaktsioon ( Mulderi reaktsioon )
~1 ml munavalgu lahusele lisasin 6 tilka kontsentreeritud HNO3 . Selle tulemusena tekkis valge sade. Loksutasin ja panin katseklaasi kuuma vee sisse- lahus muutus koheselt üleni valgeks. 3 min soojendades sain tulemuseks kollase paksu massi.
Järeldus
Kontsentreeritud lämmastikhappe juuresolekul denatureerus valk pöördumatult ja sadestus. Soojendamisel toimus aromaatsete tuumade nitreerumine- moodustus kollase värvusega nitrofenooli ühend.
Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend käitub alus/ hape indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranži värvuse.
Biureet-
Cu2+ kompleks
Uurea ( liias )
1.1.3. Milloni reaktsioon
Ühte katseklaasi panin ~1 ml munavalgu lahust, teise katseklaasi samapalju želatiini lahust. Mõlemale lisasin 6 tilka Milloni reaktiivi, mille tagajärjel munavalgu lahusele tekkis valge sade, želatiini lahus jäi aga endiseks. Järgmisena soojendasin mõlemat katseklaasin kuumas veevannis: munavalgu lahuses toimus ~3 minutiga kihistumine , kus põhi jäi vedelaks ja pisut kollakaks, ülalt aga massistus (valge) ning keskelt oli pisut punakas. Želatiini lahus, olles soojas ~4 min muutus roosakasläbipaistvaks.
Järeldus
Milloni reaktiiviga (elavhõbe(II)nitraadi lahus lämmastikhappes) reageerides andsid nii munavalk kui ka želatiin positiivse Milloni reaktsiooni, mis puhul munavalgu denatureerunud vorm sademena ja želatiini lahus muutsid värvi. Milloni reaktiiv tõestas türosiini radikaalide olemasolu, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvub roosakaks kuni tume(telliskivi)punaseks.
1.1.4. Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon
2 ml Pb( CH3COO )2 0,5%-lisele lahusele lisasin tilgakaupa 10%-list NaOH lahust; algul tekkis lahusesse sade, lisades NaOH-d piisavalt juurde, sade kadus . Järgmisena lisasin hulka ~1 ml munavalgu lahust, loksutasin, soojendasin. Soojendades ~3 min lahus muutus ülevalt pruuniks. Panin statiivile seisma ning hilisemal vaatlusel oli lahus pooleks jagatud- ülevalt pruun, alt läbipaistev.
Järeldus
Pliietanaat moodustas aluselises keskkonnas naatriumplumbaadi (algne sade kadus), soojendades pidi valgus vabanenud sulfiidioonidega tekkima PbS sade, mida ma paraku katseklaasis ei täheldanud. Katse ebaõnnestus, kuna oodatavat pruunikasmusta sadet lõpus ei tekkinud e PbS ühendit ei moodustunud. Viga võis tulla liigsest kuumutamisest.
(CH3COO)2Pb + 2NaOH→Na2PbO2 + 2CH3COOH
Na2S +Na2PbO2+2H2O→PbS↓+4NaOH
1.1.5. Valkude sadestamine trikloroäädikhappega
~1 ml munavalgu lahusele lisasin 2 tilka CCl3COOH lahust, mille tulemusena tekkisid lahusesse kollased tükid. Järegmisena loksutasin katseklaasi hoolikalt,, mille tõttu tekkis udune valge sisu katseklaasi.
Järeldus
Trikloroäädikhape (TKÄ) sadestas munavalku, mistõttu sain häguse valge vedeliku. TKÄ sadestab peptiide, mille molekulmass on üle 10 000.
1.1.6. Valkude sadestamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)
~2 ml munavalgu lahusele lisasin 2 ml (NH4) 2SO4 küllastunud lahust. Loksutades saadud lahus hägustus. Lastes seista 5 min, oli näha sademe moodustumist. Peale seda filtreerisin poole kogusest, saadud filtraadile lisasin kristalset (NH4)2SO4 kuni küllastuskontsentratsiooni saavutamiseni. Loksutasin katseklaasi hoolikalt, lisades vahepeal hulka soolakristalle, kuni sool enam ei lahustunud. Sain rohkelt sadet, mis vajus põhja.
Järeldus
(NH4)2SO4 toimel sadestusid esimeses etapis globuliinid lahusest välja. Filtreerides poole kogusest ning lisades filtraadile soolakristalle, sadestusid välja albumiinid. Võrreldes globuliinide sadet albumiinide sademega täidetud katseklaasi, võis järeldada, et munavalgus on rohkem albumiine, kui globuliine.
Esimesel korral laguneb kõrgem struktuur ( globuliin ) ning teises etapis temast järgmine molekulaarne struktuur ( albumiin ).
1.1.7. Valgu termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st
Kahte katseklaasi panin kummassegi ~2 ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisasin juurde 1 ml kontsentreeritud etaanhapet . Mõlemaid katseklaase kuumutades sain äädikhappe lisandiga lahuse puhul valge sademe, teine muutus paksuks valgeks massiks.
Järeldus
Ilma pH mõjutuseta e siin katses etaan - e äädikhappe lisamiseta denatureerunud munavalk lahusest välja ei sadestunud, äädikhappe lisamisel aga valgumolekulid agregeerusid hõlpsasti ning sadestusid lahusest välja.
H3N+—CH2—COO– H3N+—CH2—COOH
1.1.8. Valkude sadestamine orgaanilisete lahustitega
~2 ml munavalgu lahusele lisasin tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades ettevaatlikult atsetooni, kuni tekkis sade e hägustumine (lähemal vaatlusel väiksed tükid hõljusid lahuses). Seejärel lahjendasin katseklaasi sisu destilleeritud veega ja piisava koguse juures oli sade lahusest praktiliselt kadunud. Hilisemal vaatlusel sade oli katseklaasist täiesti kadunud.
Järeldus
Veega segunev orgaaniline solvend atsetoon kutsub valgumolekulis esile aminohapete apolaarsete radikaalide pöördumise veemolekulide poole, mistõttu katses munavalk dehüdratiseerus ja sadestus lahusest välja. Kui lisasin vett, siis lahustus tekkinud sade uuesti, sest vähendasin veega sadesti küllastuskontsentratsiooni. Tegu oli pöörduva denaturatsiooniga.
Süsivesikud
1.2.1. Molisch’i test
Ühte katseklaasi panin ~2 ml tärklise lahust, teise katseklaasi ~2 ml sahharoosi lahust. Mõlemasse katseklaasi tilgutasin 6 tilka Molisch’i reaktiivi, loksutasin. Tärklise lahusele tekkis piirpinnale kollane värvus, sahharoosile tekkis koheselt lillakas piirpind ( lahus oli jaotatud kaheks osaks, piirpind on kahe kihi vaheline osa). Hoides tärklise lahusega katseklaasi kaldasendis, lisasin ettevaatlikult tilkhaaval 1 ml kontsentreeritud väävelhapet (hape voolas mööda katseklaasiseina uuritava lahuse põhja)- toimus kihistumine, kus oli eristatav ülevalt poolt lugedes valge, kollane, lilla, heleroheline osa. Sahharoosiga, toimides samamoodi sain ülemise osa valge tahkja moodustise, põhjast vedel ning piirpind oli intensiivse lilla värvusega.
Järeldus
Tugevas happelises keskkonnas toimus pikapeale monosahhariidide vabanemine , suhkrud dehüdreerusid. Tekkinud produktid reageerisid edasi Molisch’i reaktiiviga (Molisch’i reaktiiv kujutab endast α-naftooli lahust alkoholis), saades lilla kihi uuritava lahuse ja happe piirpinnale.
1.2.2. Osasoonide saamine
Kahte katseklaasi valasin ühte ~2 ml fruktoosi, teise ~2 ml glükoosi lahust. Mõlemale lisasin ~0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja ~0,2 g kristallilist naatriumatsetaati ning loksutasin, kuni tahked ained olid lahustunud. Reaktsioonisegusid hoidsin järgnevad 40 min keeva veevanni sees, aeg-ajalt loksutades. Umbes 10 min peale keeva vees sees hoidmist sai juba näha kristallstruktuuride moodustumist mõlemas katseklaasis (fruktoosi puhul erksamalt). Siis jahutasin mõlemat katseklaasi jäävannis. Mikroskoobiall oli mõlemale lähtesuhkrule iseloomulik osasoonistruktuur hästi näha.
Järeldus
Taandavad suhkrud glükoos ja fruktoos reageerimisel fenüülhüdrasiiniga tekitasid osasoonid , mis keetmisel kristallusid hõlpsasti välja. Tekkinud kristallide kuju on lähtesuhkrule iseloomulikud.


1.2.3. Hõbepeegli reaktsioon
Hoolikalt pestud katseklaasi valasin 1 ml 1%-list AgNO3 lahust, lisasin 0,5 ml kontsentreeritud NH4OH lahust ja loksutasin. Seejärel lisasin ~1 ml glükoosi lahust, loksutasin segu hoolikalt ja soojendasin ettevaatlikult veevannis. 5-10 min möödumisel sai lahus endale halli värvi. Lastes veel ~15 min kuuma vee sees soojendada oli paista hõbedakihti tekkimas katseklaasi seintele . Võtsin katseklaasi ettevaatlikult, raputamata välja ning lasin veel ~19 min seista. Katseklaasi sein oli lõpptulemusena ühtlaselt hõbedaga kaetud.
Järeldus
Taandav suhkur glükoos taandas metallisoola. Reagendiks oli Tolleni reagent (aktiivseks kompenendiks AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv [Ag(NH3)2]+). Lahusest sadestus metalliline hõbe välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli.
 NaOH(aq) + AgNO3(aq) → AgOH(s)
  AgOH(s) + 2NH3(aq)(liias) → Ag(NH3)2+(aq) + OH-(aq)]
R-C(=O)H + 2Ag(NH3)2+ + 3OH- → 2Ag + RC(=O)O- + NH3 + H2O ( redoksreaktsioon )
1.2.4. Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega
Kahte katseklaasi valasin kummassegi ~1 ml sahharoosi lahust, ühele neist lisasin 1 tilk kontsentreeritud HCl. Loksutasin mõlemat hoolikalt ja asetasin katseklaasid 5 minutiks kuuma vette. HCl lahusesse tekkis koheselt punane sade. Seejärel võtsin veest välja ning lisasin mõlemasse 1 ml Fehlingi I ja1 ml Fehlingi II lahust ning loksutasin hoolikalt. HCl lahus läks üleni punaseks sademe hõljumisest, teine jäi siniseks , mis puhul värvus oli tingitud Fehlingi lahuste värvusest. Soojendasin katseklaase uuesti ~6 min ja HCl lisandiga katseklaasi põhja langes telliskivipunane sade, teise katseklaasi värvus, samuti sahharoosi lahusega, jäi endiselt samaks.
Järeldus
Fehlingi I lahus kujutab endast CuSO4 vesilahust ja Fehlingi II lahus on leeliselise K, Na-tartraadi e Seignett’i soola vesilahus . Fehlingi reaktiiv saadakse nende kahe lahuse kokkusegamisel, saadakse leeliseline vask(II)tartraatkompleks. Tekkiv Fehlingi reaktiiv reageerib aldooside või ketoosidega, vaba aldehüüd- või ketorühma toimel vask taanub, andes vask(I)oksiidi, mis punase lahusena lahusest välja sadestub. Suhkur aga oksüdeerub vastavaks happeks .
Tugevas happelises keskkonnas toimus pikapeale monosahhariidide vabanemine, mistõttu HCl lisandiga sahharoosi lahus andis positiivse Fehlingi reaktsiooni. Sahharoosi hüdrolüüsi produktid fruktoos ja glükoos reageerisid Fehlingi reaktiiviga. Oligosahhariid sahharoos aga ei sadestanud vask(I)oksiidi lahusest välja ning sellepärast sinna katseklaasi sadet ei tekkinud.
2NaOH + CuSO4 = Na2SO4 + Cu(OH)2
R-COH + 2Cu2+ + 5OH- → Cu2O ↓ + R-COO- + 3H2O (redoksreaktsioon)
1.2.5. Barfoed’ reaktsioon
Ühte katseklaasi panin ~0,5 ml glükoosi lahust, teise samapalju laktoosi lahust. Mõlemale lisasin 1,5 ml Barfoed’ reaktiivi, segasin hoolikalt ning hoidsin kuumal veevannil 2-3 minutit. Võttes välja, oli glükoosi lahusega katseklaasi tekkinud põhja punane sade, laktoosi lahuse puhul aga katseklaasi sisu jäi endiseks.
Järeldus
Nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid - katses oli selleks glükoosi lahus. Reaktsioon Barfoed’ reaktiiviga [vask(II)atsetaadi Cu(CH3COO)2 lahus äädikhappes] annab punase vask(I)oksiidi sademe. Oligosahhariid laktoos Barfoed’ reaktiiviga vaske ei taanda.
RCHO + 2Cu2+ + 2H2O → RCOOH + Cu2O↓ + 4H+
1.2.6. Selivanoff ’i reaktsioon
Ühte katseklaasi panin ~1 ml fruktoosi lahust, teise sama palju glükoosi lahust. Lisasin 2 ml Selivanoff’i reaktiivi, loksutasin. Soojendasin keeval vesivannil 4-5 min. Välja võttes oli fruktoos punakaspruunikas, glükoos aga lahjem pruunikas.
Järeldus
Selivanoff’i reaktiiv, mis kujutab endast soolhapet, kontsentreerivaks agendiks resortsinooli e benseen -1,3-diooli [C6H4(OH)2] ja katalüsaatorina FeCl3 suhkru kuumutamisel moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal. Tekkivad ühendid polükondenseeruvad mitmealuseliste fenoolidega, andes värvusi punakaspruunist tumepruunini.
1.2.7. Tärklise reaktsioon joodiga
A. ~5 ml tärklise lahusele lisasin 1 tilk joodilahust- jood , ühinedes tärklise lahusega, värvus tumesiniseks. Loksutasin ning kuumutasin keemiseni. Välja võttes oli lahus värvitu. Seejärel jahutasin, mis endaga muudatusi kaasa ei toonud .
Järeldus
Tärklis moodustas joodiga tumesinise kompleksi, mis oli tingitud polüsahhariidi ahelate keerdumisest ümber joodi molekulide. Kõrgemal temperatuuril tekkinud kompleks aga lagunes ja värv sellega kadus. Tegu oli pöörduva reaktsiooniga.
I2 + I- → I3-
I3- + (C6H12O6)n → (C6H12O6)nI3- (tumesinine)
B: Kartulitärklise terakesed olid tunduvalt suuremad kui maisitärklise terakesed ning olid ovaalsema kujuga.
Tärkliseterakesed mikroskoobiall (joonised):
Joonis1. Maisitärklis Joonis 2. Kartulitärklis