Biokeemia praktikum 2.2: Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine 1.3 Lipiidide reaktsioonid (0)

Tallinna Tehnikaülikool
2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Töö 2.2 on arvestatud.
Töö 1.3 testides on vaja formulatsioone korrigeerida .
16.03. M. Kreen
Liina Reimann
134537KATB
Arvestatud 16.03.15. M.Kreen

2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine

Taimede fotosünteesivate kudede rakud sisaldavad fotosünteesi põhipigmente – klorofülle ja abipigmente – karotenoide ja fikobiliine, mis on kas kollased , punased või purpursed. Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A eelühendiks.
Enamus toiduga seedekulglasse sattunud karotenoididest allub soole mikrofloora poolt produtseeritava ensüümi karoteeni oksügenaasi toimele ja neist moodustub vitamiin A.
Karotenoidide kaks põhigruppi on:

• Karoteenid –hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust, esindajateks on karoteeni isomeerid, samuti lükopeen
  
• Ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid, esindajateks luteiin, zeaksantiin
  

Karoteeni α-, β- ja γ-isomeeridest omab suurimat tähtsust β- karoteen (punakasoranž), mille molekul loomorganismis poolestub, andes 2 retinooli ehk vitamiin A1 molekuli.
Kõik karotenoidid on värvilised. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on tema punane värvus. Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (400-700 nm) tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus, st molekul koosneb pikast, konjugeeritud kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast.
Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi.
β-karoteen on kristalliline aine sulamistemperatuuriga 183-184 oC, mis vees ei lahustu. Etanoolis lahustub karoteen piiratud ulatuses, kuid lahustub hästi apolaarsetes orgaanilistes lahustites . Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.
Paljude konjugeeritud kaksiksidemete tõttu neelab β-karoteen valgust spektri nähtavas osas.
Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 ja 480 nm juures.
Töö eesmärgiks oli taimsetest materjalidest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ja β-karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis ning klorofülli olemasolu kindlakstegemine.
Töö käik
Uuritav materjal: punane kirsstomat

Uuritava objekti peenestamine, proovi mass: 1,62 g

Proovi peenestamine uhmris, lisatud pestud liiv. Peenestamine kuni ühtlase massi saavutamiseni.

Proovi kuivatamine - Väikeste portsionitena veevaba Na2SO4 lisamine, et proovis olevat vett siduda. Soola lisamine lõppes hetkel, mil moodustus kuiv, pulbriline mass.

Karotenoidide ekstraktsioon ehk väljalahustamine ekstrahendiga ( petrooleeter )

Võtsin 100ml mõõtesilindri, et ekstrakti koguda, lisaks lehtri, millele asetasin kuiva filterpaberi.

Lisasin uhmris olevale peenestatud massile väikeste koguste kaupa petrooleetrit.

Põhja settinud massilt eemaldasin ekstrakti teelusika abil filtrile.

Kordasin seda, kuni sademe kohal oleva ekstrakt muutus värvusetuks.

Kõik ekstraktid viisin samasse kogumisnõusse.

Määrasin kindlaks ekstrakti kogumahu V= 43 ml

Edasi uurisin saadud ekstrakti neeldumisspektri all. Spekter mõõtis vahemikus 350-600 nm.
Tulemused:
Neeldumismaksimumid:
I 530 nm; 0,298 A
II 471 nm ; 0,361 A
( E1cm1% = 3454 )
II 446,5 nm; 0,260 A
Kirjanduse alusel domineerib paprikas lükopeen neeldumismaksimumidega 446, 474, 506 nm.
Karotenoidi sisalduse arvutamine
See tähendab, et 100g punast kirsstomatit sisaldab 1,8 mg lükopeeni.
D – ekstrakti optiline tihedus= 0,361
ekstinktsioonikoenfisent e. absorptsioonikoenfisent on teatava lainepikkusega valguse absorptsiooni väärtus antud ühendi 1%-lise lahuse läbimisel, kui kihi paksus on 1 cm.
(lainepikkusel 472 nm 3450)
V – ekstrakti kogumaht = 43 ml
d – ekstrahendi tihedus= 0,65g/cm3
g – uuritava proovi mass= 1,62 g
103 – tegur üleminekuks milligrammidele.
Kokkuvõte
Kõige rohkem sisaldab tomat karotenoididest lükopeeni. Kirjanduse aluses sisaldavad tomatid 100g kohta 8,8-42 mg lükopeeni , mis tähendab, et saadud tulemus jäi alla kirjandusliku. Muidugi võib arvesse võtta, et kasutasime niiöelda talveperioodi tomatit, mis võib sisaldada ka karotenoide palju vähem.

1.3 Lipiidide reaktsioonid

Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekuli iseloomustab enamasti estersidemete esinemine. Reegline ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustites, vähesel määral lahustuvad nad polaarsetes solventides ( metanool , etanool ) ja hästi lahustuvad apolaarsetes orgaanilistes solventides nagu triklorometaan (kloroform), tetraklorometaan , benseen ja eeter .
Lipiidid on kõikides organismides rakumembraanide põhiliseks koostiskomponendiks. Neil on veel energeetilise varuaine funktsioon, kaitse- ja regulatoorne funktsioon, nad on signaalimolekulideks ja mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus.
Lipiidide rühmad: rasvhapped , rasvad , glütserofosfolipiidid, sfinolipiidid, vahad, steroidid , terpenoidid.

1.3.1 Rasvapleki proov

Kõik lipiidid lahustuvad orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse kandmisel paberile, jääb paberile rasvaplekk , millest paberi läbipaistvus suureneb. Oluline on uurida just kuivatatud proovidega paberit!
Töö käik: Võtan kahte katseklaasi 1g erinevat tahket materjali (proov I ja proov II). Mõlemasse katseklaasi lisan 0,5 ml orgaanilist lahustit , milleks on atsetoon. Loksutan ja lasen settida umbes 5 minutit. Võtan klaaspulgaga proovi ja panen filterpaberile.
Tulemus: Kuiva paberit vastu valgust vaadates selgus, et I proovi filterpaberile ei jäänud midagi ja II proovi omale jäi rasvaplekk.
Järeldus: See tähendab, et II proov sisaldas lipiide.

1.3.2 Emulsioonitest

Emulusiooni nimetatakse ka kolloidiks. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus (pidevas faasis) Kuna Emulusioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks.
Töö käik: Kirjeldage konkreetselt testi läbiviimist! Emulusioonid uuritavad lahused olid valmis – Emulusioon I ja Emulusioon II. Üks nendest vesi-õli tüüpi emulusioon, teine õli-vesi tüüpi emulusioon. Mõlemasse lisasin 4ml destilleeritud vett ja loksutasin intensiivselt. Emulusiooni II segu läks loksutamisel häguseks.
Tulemus: Katseklaasis, kus oli Emulusioon I ei muutunud loksutamise tulemusena midagi, proov jäi läbipaistvaks, katseklaasis, kus oli Emulusioon II läks segu häguseks.
Järeldus: Emulusioon II sisaldas lipiide

1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides

Küllastumata rasvahepete esinemise kindlakstegemisel kasutatakse reaktsiooni halogeenidega – täpsemalt broomiga. Kui proov sisaldab küllastumata rasvhappeid , muutub lahus liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.
Töökäik: Valasin 3-me katseklaasi: palmithapet, rapsiõli ja searasva. Kõikidesse katseklaasidesse lisasin tilkhaaval võrdset kogust broomi lahust triklorometaanis. Loksutasin. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks lahus säilitama kollakas -pruuni värvuse, teises kahes toimub värvuse muutus.
Tulemus: Palmithape jääb kollakas-pruuniks, järelikult ei reageeri. Nii rapsiõli kui ka läksid kollaseks.
Järeldus: Palmithape ei sisalda küllastumata rasvhappeid ? Mis ühend on palmithape? Õige formulatsioon! , küll aga rapsiõli ja searasv sisaldavad. Palmithape on küllastunud rasvhape, rapsiõli ja searasv on küllastumata rasvhapped.

1.3.5 Liebermann -Burchard’i kolesterooli määramise test

Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas-rohelise värvusega reaktsioonisegu.
Töö käik: Valasin 3-me katseklaasi kolesterooolilahust, rapsiõli, võid. Lisasin 6 tilka värsket äädikahappe anhüdriidi ja 4 tilka konsentreeritud väävelhapet, seejärel loksutasin.
Tulemus: Kolesterooli lahus muutus tume sinakas-roheliseks, järelikult sisaldab rohkel kolesterooli. Rapsiõli lahus oli rohkeas-punane (sisaldab näiteks fütosterooli) ja või lahus helesinine.