Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine, lipiidide reaktsioonid (0)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemiainstituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
2.2 Karotenoidide identifitseerimine ja sisalduse määramine
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Laboratoorsed tööd
Juhendaja : Tiina Randla
Teooria:
Karotenoidid on fotosünteesi abipigmendid taimedes, mis on kas kollased või punased. Karotenoidid on loomsetes organismides vitamiin A provitamiiniks ehk eelühendiks. Karoteeni alba , beeta ja gamma isomeeridest omab suurimat tähtsust beeta- karoteen , mis on punakasoranži värvusega isoprenoidne ühend, mille molekul loomorganismis poolestub, andes kaks retinooli, ehk vitamiin A molekuli.
Beeta-karoteen on kristalliline aine, mille sulamistemperatuur on 183-184 kraadi ja vees ta ei lahustu. Etanoolis lahustub karoteen piiratud ülatuses, kuid apolaarsetes orgaanilistes lahutsites lahustub hästi. Kuna beeta-karoteeni molekul, nagu teisedki karotenoidid, sisaldab hulgaliselt konjugeetirud kaksiksidemeid , siis neelab ta intensiivselt valgust spektri nähtavas osas. Seetõttu iseloomustema karoteeni sisaldust uuritavas materjalis neeldumisspektri järgi.
Antud töö eesmärgiks on taimsetest materjalidest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle aluses uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine.
Töö käik:

Uuritavaks taimseks materjaliks oli paprika , mille lõigasin ning kaalusin tehnilisel kaalul , kaalutiseks 0,5095 g.

Lõplikuks peenestamiseks hõõrusin porgandit uhmris vähese pestud liivaga kuni ühtlase massi saavutamiseni.

Seejärel lisasin sinna ükskikute portsjonite kaupa veevaba naatriumsulfaati, mille kogus tuli umbes 5-10 kordne kaalutise suhtes. Hõõrusin kuni saavutasin ühtlase kuiva pulbri.

Järgnes karotenoidide ekstraktsioon sobiva orgaanilise lahustiga, milleks kasutasin petrooleetrit, tihetusega 0,69. Ekstrakti valasin klaaslehtri ja filterpaberiga varustatud mensuuri. Ekstraheerisin korduvalt, kuna uurisime karotenoide kvantitatiivselt. Ekstraheerimise lõpetasin, kuni ekstrakt oli värvitu.

Ekstrakti mõõtsin ära mensuuris, ja mahuks sain 18,5ml.

Järgmiseks võtsin ekstrakti neeldumisspektri spektrofotomeetris, võrdluslahusena kasutasin puhast petrooleetrit.
Lainepikkuseks 350-650nm.
Spektrite lainepikkused :
473,5nm 449 nm 424,0nm
Kirjanduse alusel leidsin beeta-karoteeni neeldumisspektrid: 425, 451, 482, selest saan järeldada, et domeneerivad beta -karotenoidid.
Beeta-karoteeni sisalduse uuritavas proovis arvutan vastavalt valemile:
A * V * d * 103
K=------------------------------ mg%
E1%1cm * g
Kus
A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile λmax (kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus),
Ε1cm1% – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama λmax juures,
V – ekstrakti kogumaht , ml,
d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3,
g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g,
103 – tegur milligrammidele üleminekuks.
1,334 *18,5 * 0,69 * 103
K=------------------------------=18,9 mg%
2560*0,5095 * g
Kokkuvõte:
Prooviks oli paprika. Selles materjaalis domeneeris beta-karotenoidid. Leidsin kirjanduses1, et nende sisaldus 100 grammis värske produktis peab olema 20, mis on üsna sarnane minu tulemusega.
Kasutatud kirjandus:

http://europepmc.org/abstract/AGR/IND20531193/reload=0;jsessionid=Ju5jhq1rvnPCKTWkO1vF.18
1.3 Lipiidide reaktsioonid
Teooria:
Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, kuhu kuuluvad ained on oma keemiliselt ehituselt enamasti estrid. Reeglina lipiidid vees ei lahustu, kuid lahustuvad orgaanilistes solventides, teistes lipiidides ning leelismetallide soolade lahustes. Lipiidide omadus mitte vees lahustuda põhineb hüdrofoobsete aatomirühmade ja radikaalide sisaldusest. Lipiidid kuuluvad rakumembraanide koostisesse, on loomsetes organismides energeetiliseks varuaineks ning täidavad mitmesuguseid kaitse-ja regulatoorseid funktsioone.
1.3.1 Rasvapleki proov
Lipiidid lahustuvad orgaanilistes lahustites . Kui lipiidi sisaldavat lahust kanda paberile, tekib rasvaplekk ja paberi läbipaistvus suureneb. Vastu valgust vaadates on rasvaplekk heledam, pimeda poole vaadates tumedam . Järeldusi saab teha kauiva prooviga.
Töö käik
Kahte katseklaasi panin umbes 1g kummastki tahke aine proovist. Mõlemasse valasin umbes 0,5 ml orgaanilist lahustit ja lasin 5 min seista. Mõlemast katseklaasist kandsin tilga paberile ja kuivatasin.
Järeldus: Vaatasin paberit vastu valgust ning õrnalt oli näha, et paberil , milles oli olnud proov nr 2 oli õrn plekk . See täheldas lipiidide olemasolu antud proovis.
1.3.2. Emulsioonitest
Emulsiooni moodustumisest annab märku selge lahuse muutumine häguseks, sest emulsioonid hajutavad läbivat valgust. Kui orgaanilises solvendis lahustatud rasv viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt loksutada, tekib õli-vees tüüpi emulsioon .
Töö käik
Kahte kuiva katseklaasi valasin 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutatasin. Seejärel lisasin mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutasin veel. Lipiidi sisaldavas katseklaasis muutub segu häguseks.
Järeldus:Hägusus tekkis teise proovi sisaldavas katseklaasis, seega see sisaldab lipiide.
1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides
Küllastumata rasvhapete esinemist lipiidides uuritakse halogeenidega reaktsiooni abil. Küllastunud rasvhappeid sisaldav proov moodustab broomiga pruuni värvuse, küllastumata rasvhapete korral muutub lahus momentaalselt värvituks.
CH3(CH2)CH=CH(CH2)mCOOH + Br2 → CH3(CH2)nCHBr-CHBr(CH2)mCOOH
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatsin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: rasvhappe (palmitiinhape), taimse rasva (oliivõli) ja loomse rasva ( searasv ) lahust. Igasse katseklaasi lisasin tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka) broomi lahust kloroformis e triklorometaanis, loksutasin. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks broomi lahus säilitama iseloomuliku kollakas -pruuni värvuse, teistes kahes aga toimub värvuse muutus.
Järeldus:Palmithappe ja broomi lahus muutus oranžiks, teised praktiliselt värvituks, kuid searasva lahus oli pisut tumedam kui oliivõli oma. Võib järeldada, et esimeses lahuses (palmithape ja broom ) oli rasvhape küllastunud. Teistes lahustes olid küllastumata rasvhapped , kuid oliivõli ehk taimse rasva lahus oli kõige vähem küllastunud.
1.3.5 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test
Kui kolesterooli reageerib äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas muutub lahus tume sinakas-roheliseks. Reaktsioon on mitmeastmeline ja tekivad ka punane ja sinine vaheühend. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud palju reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone nagu näiteks steraanituuma oksüdeerumine ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõpuks tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. C17 asendis paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.
Töö käik
Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valasin igasse 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis (kolesteroolilahus, taimse-rapsõli ja loomse rasva lahust-või). Igasse katseklaasi lisasin 6-7 tilka äädikhappe anhüdriidi ja 4-5 tilka konts. väävelhapet. Loksutasin hoolikalt.
Järeldus:Esimeses katseklaasis oli kolesteroolilahus, teises rapsiõli ja kolmandas searasv. Esimene lahus värvus äädikhappe anhüdriidi ja väävelhappe lisamisel tumesinakasroheliseks Teistes katseklaasides olid lahused kollakaspunakad. Taimerasvas ei sisaldunud kolesterooli, küll aga mingil määral searasvalahuses.