Glükoosisisalduse määramine (3)

TTÜ Keemiainstituut, Biorgaanilise keemia õppetool, YKL0060
Laboratoorne töö: nr. 3
Töö pealkiri:
Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Õpperühm: YAGB22
Töö teostaja :
Õppejõud: Malle Kreen
Töö teostatud: 15.03.2010
Protokoll esitatud: 28.03.2010

3.5 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil

Töö teoreetilised alused:

• Bioloogilistes vedelikes kasutatakse glükoosisisalduse määramiseks enamasti ensümaatilist meetodit. See põhineb kahe ensüümi – glükoos oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD) kasutamisel .
  
• GOD on substraadispetsiifiline β,D-glükoosi suhtes (tänu sellele võimaldab see meetod määrata glükoosisisaldust teiste taandavate suhkrute juuresolekul).
  
• GOD (β,D-glükoosi:O2-oksüdoreduktaas) katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GOD on liitvalk (flavoproteiin) ja sisaldab prosteetilise grupina (mittevalguline komponent ) flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib kui koensüüm.
  
• FADi abil kantakse glükoosi molekulilt kaks H aatomit hapnikule, selle tulemusel glükoos oksüdeerub glükoonhappeks ja tekib FADiga ekvimolaarses koguses vesinikperoksiidi.
  

• POD ( doonor , H2O2-oksüdoreduktaas) osaleb reaktsiooni järgmises etapis . POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem.
  
• POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks.
  
• Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril.
  

Töö käik:
Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis ( mesi ).
Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas.
Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes.
Töö reaktiivi koostis : (25 ml kolvis sisaldub)

• 2,5 mg GOD
  
• 1,5 mg POD
  
• 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0
  
• K3[Fe(CN)6] (K-heksatsüanoferraat(II)) 0,1% lahus, mis täidab kolvi märgini.
  

Uuritava proovi (mee lahus) ettevalmistamine:

Kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,11 g mett.

Viisin meeproovi kvantitatiivselt (kadudeta) 200 ml mõõtekolbi (et ei peaks rohkem lahjendama). Selleks kasutasin kuuma dest. vett. Loputasin kaaluklaasi 3 korda.

Täitsin 2/3 kolvi mahust kuuma dest veega ja hoidsin kolbi 15 minutit kuumas vesivannis, loksutasin aeg-ajalt.

Kontrollisin lahuse pH väärtust universaalindikaatorpaberiga, ei olnud vaja lahust neutraliseerida.

Täitsin kolvi märgini külma dest. veega, sulgesin korgiga ja loksutasin.
Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks :

Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml.

Alglahuses ja lahjenduses sisaldub üks ja sama ainehulk : Cst * Vst = Clahj * Vlahj.

0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 15 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin. Sain 20 ml 1. lahjendust.

0,125 mg/ml lahjendus: pipeteerisin katseklaasi 5 ml 0,25 mg/ml lahjendust ja lisasin sellele 5 ml destilleeritud vett, loksutasin. Sain 10 ml 2. lahendust .

0,062 mg/ml lahjendus: pipeteerisin katseklaasi 5 ml 0,125 mg/ml lahendust ja lisasin 5 ml destilleeritud vett. Sain 10 ml 3. lahjendust.
Reaktsiooni läbiviimine (toatemperatuuril):

Markeerisin 6 kuiva ja puhast katseklaasi ja asetasin need statiivi.

Katseklaas nr. 1: pipeteerisin sinna 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni).

Katseklaasid nr. 2 ja 3: 1 ml mee lahust (paralleelproovid).

Katseklaasid nr. 4,5 ja 6: pipeteerisin igasse katseklaasi 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.

Pipeteerisin igasse katseklaasi 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin koheselt. Fikseerisin aja ja hoidsin katseklaase 20 min toatemperatuuril.

Katseklaasides olevad lahuses värvusid kollaseks (ka kontrollproov), see toimus K3[Fe(CN)6] toimel ja näitas glükoosi olemasolu.

Mõõtsin spektrofotomeetril ( lainepikkus 410 nm) lahuste optilised tihedused , võrduslahuseks destilleeritud vesi.

Kuna ka kontrollproov andis madala optilise tiheduse väärtuse (tööreaktiivi komponentide tõttu), lahutasin glükoosi sisaldavate lahuste (katseklaasid 2-6) optiliste tiheduste väärtustest kontrollproovi oma).
Kaliibrimisgraafiku koostamine:
Optilised tihedused (katseklaasid 2-6 korrigeeritud), lainepikkus 410 nm
katseklaas nr. 1: kontrollproov (dest. vesi)
0,133
nr. 2: mesi I
0,083
nr. 3: mesi II
0,087
nr. 4: glükoosilahus (konts. 0,25 mg/ml)
0,109
nr. 5: glükoosilahus (konts. 0,125 mg/ml)
0,039
nr. 6: glükoosilahus (konts. 0.062 mg/ml)
0,015
Saadud andmete põhjal koostasin graafiku (x- teljel glükoosi kontsentrasioon (C), y-teljel sellele vastav ABS). Graafik peaks olema koordinaatide alguspunkti läbiv sirge (korrektne katse).
ABS
C
Sirge ei läbi lineaarselt kõiki nelja punkti katsevea tõttu.
Glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine :
Glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses leian kaliibrimisgraafikult vastavalt paralleelproovide keskmisele optilise tiheduse väärtusele (0,085).
Valem:
X =
X – glükoosisisaldus uuritava proovi kuivaines %
(kaliibrimissirge järgi) mg/ml
C – glükoosi konts. uuritavas lahuses
0,21 mg/ml
V1 – uuritava lahuse üldmaht ml
200 ml
L – lahjendustegur
1
10-3 – tegur üleminekuks grammidele
10-3
V2 – värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetud uuritava lahuse üldmaht ml
1 ml
G – uuritava materjali (mesi) kaalutis
0,11 g
W – uuritava materjali niiskusesisaldus (mees tavaliselt 17%) %
17 %
Järeldus: Katses kasutatud meeproovis (kuivaine) sisaldus 46,002 % glükoosi.
Kas tulemus on tõepärane – võrdlus kirjanduse andmetega ?
Fruktoosi- ja glükoosisisaldus õiemees vähemalt 60 grammi 100 grammi kohta; lehemees ja lehemee ning õiemee segus vähemalt 45 grammi 100 grammi kohta.
Mee koostis- ja kvaliteedinõuded ning märgistamise erinõuded1
Vabariigi Valitsuse 19. veebruari 2004. a määrus nr 41
Ehk siis vastavalt 60% ja 45%. Minu proovi protsendiline sisaldus oli lähedasem lehemee ja lehemee/õiemee segu glükoosisisalduse protsendile.