Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

3. Biokatalüüs

3.3 Glükoosi sisalduse määramine ensümaatilisel moel

Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides (vereseerum, toiduained, taimne tooraine jms) kasutatakse ensüüme glükoosi oksüdaas (GOx) ja peroksüdaas (POx).

3.3.1. Töö teoreetilised alused

3.3.1.1 Glükoosi oksüdaas

Joonis 1. Glükoosi oksüdaas.
Struktuur:

• Liitvalk ehk konjugeeritud valk (flavoproteiin)
  
• Sisaldab koeensüümina toimivat mittevalgulist komponenti FAD-i
  
• Molekul on dimeerne valk (koosneb 2 subühikust, mis pildil kahe erineva sinisega)
  
• Sisaldab FAD-i molekule (tähistatud roosaga )
  
• polüsahhariidi ahelad , mis stabiliseerivad ensüümvalku (tähistatud rohelisega )
  

Toimuvad protsessid:

• FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit ⟹ redutseerub FADH2-ks ⟹ kantakse üle molekulaarsele hapnikule (sisaldub lahustunult reaktsioonikk-s)
  
• Tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja H2O2
  

Joonis 2. D-glükoonhape (ja H2O2) tekkimise protsess.
Tähtis informartsioon:
Süstemaatiline nimetus: β,D-glükoosi: O2-oksüdoreduktaas (EC 1.1.3.4)
Funktsioon: katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerimist molekulaarse hapniku toimel
Reaktsiooniproduktid: H2O2 ja δ,D-glükonolaktoon (kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe
Tabel 1. Ülevaatlik informatsioon GOx-i kohta.

3.3.1.2 Rõika peroksüdaas

Süstemaatiline nimetus: doonor : H2O2-oksüdoreduktaas (EC 1.11.1.7)
Funktsioon: katalüüsib spetsiifiliste substraatide (e--doonorite) oksüdeerumist (=dehüdreerumist), kasutades e—-de akseptorina H2O2, mille redutseerumisel moodustub vesi.
Reaktsiooniproduktid:
KROMOGEENNE SUBSTRAAT – substraat, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, mida saab kasutada POx-i reaktsooni jälgimiseks fotomeetriliselt

• Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.
  

Struktuur:

• Liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi ( hemo - ehk kromoproteiin)
  

Tabel 2. Kokkuvõtlik informatsioon POx-i kohta
Reaktsiooni mehhanism :
Joonis 3. Peroksüdaasi reaktsiooni mehhanism
Omadused:

• Oksüdeerib kromogeenseid substraate nagu bensidiini derivaadid (diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, 2-tolidiin e o-tolidiin jt)
  
• O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine, detekteeritav lainepikkusel 630 nm
  

Joonis 4. O-tolidiini taandatud vormi reageerimine vesinikperoksiidiga- värvilise kompleksi teke
Glükoosisisalduse määramisel ei tohiks bioloogilises objektis lihtsustuse mõttes olla märkimisväärselt värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat (II).

3.3.2. Töö käik

TÖÖREAKTIIVI ETTEVALMISTAMINE:
Tööreaktiiv peab sisaldama glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaaso (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraat (II) ja vajalikku kk-a loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0.
Tööreaktiivi valmistamine:

Võta 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks vastav mõõtekolb

Vii sellesse 2,5 mg Gox-i

Lisa 1,5 mg Pox-i

Lisa 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0

Lisa K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust kolvi kuni vajaliku mahuni täitmiseni.

Säilita külmkapi temperatuuril
Minu uuritavaks lahuseks oli sidrunimahl .

Pressin kaaluklaasi 2-3 ml sidrunimahla

Teen 100-kordse lahjenduse (1 ml sidrunimahlale lisan destilleeritud vett kuni 100 ml mõõtkolvi kriipsuni

Filtreerin saadud lahjenduse läbi paberfiltri katseklaasi, et viljaliha eemaldada
STANDARDLAHUS – sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml

Võtan 3 puhast ja kuiva kalibreeritud katseklaasi ja valmistan glükoosi standardlahusest kolm lahjendust:

Mõõdan esimesse katseklaasi 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett

Teise katseklaasi võtsin 5 ml lahust eelmisest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett

Kolmandasse katseklaasi võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett

Sain glükoosi standardlahusest kolm lahjendust kontsentratsioonidega :

0,25 mg/ml

0,125 mg/ml

0,062 mg/ml

Panen statiivi 6 kuiva ja puhast katseklaasi. Tähistasin need: 1, 2a, 2b, 3, 4, 5
NULLPROOV – näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni
Katseklaas
Sooritatud tegevus
KATSEKLAAS 1 (NULLPROOV!)
Pipeteerisin 1 ml destileeritud vett + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
KATSEKLAAS 2a (PARALLEELPROOV!)
Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
KATSEKLAAS 2b (PARALLEELPROOV!)
Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
KATSEKLAAS 3
Pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml + 3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
KATSEKLAAS 4
Pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/ml+3 ml tööreaktiivi + loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
KATSEKLAAS 5
Pipeteerisin mL glükoosilahust, mille kontsentratsioon oli 0,062 mg/ml+ 3 ml tööreaktiivi+loksutasin ühtlase kontsentratsiooni saamiseks
Tabel 3. Katseklaasides sooritatud tegevused

Hoian katseklaasi 20 minutit toatemperatuuril, et teooria osas kirjeldatud reaktsioonid jõuaksid toimuda, mille tulemusena glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva K-heksatsüanoferraat (II) toimel kollaseks.

Mõõtsin spektrofotomeetriaga lahuste optiliste tiheduste väärtused (λ=410 nm). Võrdlahusena kasutasin destilleeritud vett.
KATSE TULEMUSED JA ANALÜÜS:
Optiline tihedus (ABS)
Korrigeeritud optilise tiheduse väärtused (D)
Glükoosi sisaldus (mg/ml)
Katseklaas 1 (nullproov)
dest. vesi+tööreaktiiv
0,065
0
Katseklaas 2a
(paralleelproov)
sidrunivesi +tööreaktiiv
0,077
0,077-0,065=0,012
Otsitav
Katseklaas 2b
(paralleelproov)
sidrunivesi+tööreaktiiv
0,078
0,078-0,065=0,013
Otsitav
Gl Katseklaas 3
4x lahjendus+ tööreaktiiv
0,218
0,218-0,065=0,153
0,25
Gl Katseklaas 4
2x lahjendus+ tööreaktiiv
0,141
0,141-0,065=0,076
0,125
Gl Katseklaas 5
2x lahjendus+ tööreaktiiv
0,099
0,099-0,065=0,034
0,062
Tabel 4. Katse tulemused ( spektrofotomeetria )
Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu, siis korrigeerisin kõikide glükoosi sisaldavate lahuste optilise tiheduse väärtuseid, lahutades neist kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse. Korrigeeritud väärtusi tuleb kasutada kalibreerimisgraafiku koostamisel.
KALIBREERIMISGRAAFIKU KOOSTAMINE JA GLÜKOOSI KONTSENTRATSIOONI KINDLAKSTEGEMINE :
Kalibreerimisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide absorptisooni väärtuste alusel. Graafiku x- telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C) ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust (ABS).
Excelisse sisestatud tabel:
Glükoosi sisaldus (mg/ml)
Optiline tihedus (ABS)
0
0
0,062
0,034
0,125
0,076
0,25
0,153
Tabel 5. Sisestatud katseandmed
Saadud graafik :
Joonis 5. Katseandmete põhjal saadud kalibreerimisgraafik
Sirge läbib põhimõtteliselt kõiki nelja punkti lineaarselt.
GLÜKOOSI KONTSENTRATSIOONI KINDLAKSTEGEMINE:
Leian glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses kaliibrimisgraafikult vastavalt paralleelproovide keskmisele optilise tiheduse väärtusele :
Kaliibrimissgraafikult leidsin, et sellele optilisele tihedusele vastab glükoosi kontsentratsioon:
Cglükoos/sidrunimahl = 0,022 mg/mL (100 korda lahjendatud lahuses)
Tundmatu proovi glükoosisisaldus on seega:
Leian glükoosisisalduse mahlas ( kuivainesisaldus pole kindlaks määratud), avaldan glükoosisisalduse massiprotsentides (X,%) naturaalse mahla suhtes vastavalt valemile:
kus
C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /ml)
L – mahla lahjendustegur
d – mahla tihedus (g /cm3) d = 1,026 g/cm3 (internetist)
Seega:

3.3.3 Kokkuvõte

Katse tulemusena leidsin, et sidrun sisaldas 2,2 mg glükoosi 100 g kohta, mis teeb protsentides 0,22% (100-kordse lahjenduse puhul).
Interneti andmetel sisaldub 100 g sidrunimahlas 0,5 g glükoosi ehk glükoosisisaldus on 0,5%. Võib järelda, et minu sidrun oli tavalisest sidrunist poole hapum. Hapusus võib aga oleneda päikesevalguse hulgast suvel, sordist vms.
Kaliibrimisgraafiku punktid ei asetsevad lineaarsel sirgel. Katse on õigesti sooritatud.