Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil (0)

TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Biokeemia praktikumi laboratoorne töö
3.2 Glükoosisisalduse määramine ensümaatilisel meetodil
Üliõpilane: Liis Hendrikson
Matrikli nr: 104191
Õpperühm: KATB 41
Juhendaja : Tiina Randla
3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL
Töö teoreetilised alused:
Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides (vereseerum, toiduained, taimne tooraine ) kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi
ja peroksüdaasi
kasutamisel. Tänu glükoosi osküdaasi substraadispetsiifilisusele glükoosi suhtes võimaldab meetod määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul.
Glükoosi oksüdaas katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.
Glükoosi oksüdaas kujutab endast joonisel näidatultki liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi , mis toimib koensüümina. Glükoosi oksüdaasi molekul on dimeerne valk (kaks subühikut, mis joonisel on eritooniliste siniste värvustega näidatud). Roosaga on joonisel näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad, mis on tähistatud rohelisega.
Glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit seob FAD, redutseerides -ks ja kannab need molekulaarsele hapnikule, mis on lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.
Ka peroksüdaas on koostiselt liitvalk , mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo - ehk kromoproteiin. Peroksüdaas katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (ehk dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi.
Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat ), siis saab peroksüdaasi reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem:
Peroksüdaas
Oksüdeeritud substraat + H2O2 → Taandatud substraat + 2 H2O
Värvusetu Värviline
Peroksüdaasi toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate. O-tolidiini okspüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm.
Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina ka kollast veresoola . Peroksüdaas katalüüsib
oksüdatsiooni -ks, sealhulgas vesinikperoksiid redutseeritakse veeks . Tekib punane veresool , mis annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb peroksüdaasile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas .
Peroksüdaas
2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ → 2 Fe3+ + 2 H2O
Käesolevas töös määratakse glükoosisisaldus mingis bioloogilises objektis, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. Peroksüdaasi substaadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II).
Töö käik:
Mahl või mõni muu vedelik

• Tundmatuks prooviks oli värskest sidrunist pressitud sidrunimahl, millest tegin lahjenduse .
  
• Filtreerisin sidrunimahla viljalihast.
  

Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamine
Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt .

• Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust järgmiselt. kontsentratsiooniga standardlahust pipeteerisin sobiva suurusega katseklaasi 2,5 ml, millele pipeteerisin 7,5 ml destilleeritud vett. Katseklaasi sulgesin korgiga ning loksutasin glükoosilahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahjendatud glükoosilahust teise kuiva katseklaasi ning pipeteerisin sinna sama palju destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katselaasi korgiga ja loksutasin kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahust kolmandasse katseklaasi ning samuti 5 ml destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin segamini. Antud lahjenduste katseklaasid olid vastavalt märgistatud.
  

Värvusreaktsiooni läbiviimine
Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures.

• Asetasin katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja nummerdasin.
  
• Kontrollkatse ehk 0- proov , mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viisin läbi destilleeritud veega.
  
• Filtreeritud sidrunimahlaga tegin 2 paralleelkatset, glükoosi standarslahusest valmistatud lahjendustega igaühega 1 katse.
  
• Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett.
  
• Katseklaasidesse nr 2 ja 3 pipeteerisin 1 ml filtreeritud sidrunimahla.
  
• Katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 pipeteerisin igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust.
  
• Igasse katseklaasi pipeteerisin 3 ml tööreaktiivi ja loksutasin kohe, et saavutada ühtlane kontsentratsioon.
  
• Fikseerisin reaktsiooni alguse aja ja katseklaasi hoidsin 20 minutit toatemperatuuril.
  
• Mõõtsin lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused.
  

Optilised tihedused (D) katseklaasides:
Nr 1: 0,050 ABS
Nr 2: 0,420 ABS
Nr 3: 0,411 ABS
Nr 4: 0,159 ABS
Nr 5: 0,118 ABS
Nr 6: 0,086 ABS
Korrigeeritud optiliste tiheduste väärtused:
Nr 2: 0,370 ABS
Nr 3: 0,361 ABS
Nr 4: 0,109 ABS
Nr 5: 0,068 ABS
Nr 6: 0,036 ABS
Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
Kaliibrimisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovige (katseklaasid 4, 5, 6) absorptsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel.
Glükoosi kontsentratsiooni sidrunimahlas leian kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi.
Glükoosi kontsentratsioon lahjendatud lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule optilise tiheduse 0,365 ABS juures:
Glükoosisisaldus massiprotsentides
naturaalse mahla suhtes arvutatakse vastavalt valemile:
Kus: glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kaliibrimissirge järgi, .
mahla lahjendustegur
mahla tihedus,
Katseandmed :
1
Järeldused:
Antud katses määrasin glükoosisisaldust värskest sidrunist pressitud sidrunimahlas. Katse tulemusena sain, et antud katses kasutatud sidrun sisaldas 0,9 % glükoosi.
Toidu koostise andmebaasi andmetel sisaldab 100 g sidrunimahla 0,5 g glükoosi ehk 0,5 %.2
Antud katse võib lugeda üsna õnnestunuks. Minu tulemus siiski erineb veidi kirjanduse andmetest. Viga võis sisse tulla ka glükoosilahuste lahjendamisest, mille järgi tegin kaliibrimisgraafiku, sest katse korrektsel läbiviimisel oleks pidanud kaliibrimisgraafik olema sirge, mis läbib koordinaatteljestiku 0-punkti. Minu kaliibrimisgraafikut vaadates näeme, et katsepunktid on küll joonestatud sirgele väga lähedal, kuid mitte kõik ei asu sirge peal ning sirge lõikub y-teljega veidi 0-punktist kõrgemal, mis ilmselt veidi mõjutas ka minu katsetulemust.
Samuti võis kirjanduse andmete ja minu tulemuse erinevus tulla ka sellest, et sidrunid üldiselt on erinevad (happelisuse ja glükoosisisalduse poolest) ning kui kirjanduse andmed on ilmselt määratud paljude erinevate sidrunite uurimise tulemusena, siis mina kasutasin oma katses vaid ühte sidrunit .
1 http://www.aqua-calc.com/page/density-table/substance/Lemon-blank-juice-coma-and-blank-raw
2 Toidu koostise andmebaas , http://tka.nutridata.ee/showFood.action?food.id=1924 .