Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (1)

Tallinna Tehnikaülikool
3.4 Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine
Üliõpilane:
Juhendaja :
Tallinn 2010
Töö teoreetilised alused
Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on rühm ensüüme, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi valkudes ja peptiidides. Reaktsiooniproduktideks on peptiidid ja vabad aminohapped . Valkude hüdrolüüsi nimetatakse proteolüüsiks.
Proteolüütiliste ensüümide aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide (aminohapete ja peptiidide) hulga kaudu, sest hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav.
Aktiivsuse määramisel kasutatakse erinevaid substraate ja iga ensüümipreparaat lahustatakse talle sobiva pH-ga puhvris. See sõltub uuritava proteaasi substraadi spetsiifilisusest ja aktiivsuse pH-optimumist. Proteaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse erinevaid pH piirkondi: hapud proteaasid, neutraalsed ja leelisproteaasid. Selles töö toimus uuritava proteaasi aktiivsuse määramine pH=8,4 juures.
Antud töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini . Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja peptiidid sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi.
Mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisaldus määratakse spektrofotomeetriga. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.
Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks on 1 μkat. See on ensüümi hulk, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 sekundi vältel 30 °C juures.
Töö käik
Kõigepealt valmistasin 5 ml uuritavat proteaasi lahust. Selleks kaalusin 0,0049 grammi tahket ensüümipreparaati (Alcolase) ja lahustasin selle boraatpuhvris 5 ml-ni (pH=8,4).
Järgnevalt pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin lahuse kümneks minutiks vesitermostaati 30 °C juurde soojenema.
Samal ajal kui lahus soojenes, pipeteerisin nelja kuiva katseklaasi, igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust.
Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, lisasin sellele 1 ml uuritavat proteaasi lahust, loksutasin ning võtsin kohe kuiva pipetiga 3 ml seda hüdrolüüsisegu ja viisin esimesse katseklaasi, kus oli TKÄ lahus ja loksutasin hoolega. Kohe oli näha valkja sademe moodustumist.
Viis minutit pärast seda toimingut võtsin uuesti 3 ml seda hüdrolüüsisegu, mille viisin teise katseklaasi, kus oli TKÄ lahus, loksutasin. Sama toimingut kordasin 5-minutiliste intervallidega ka kolmanda ja neljanda katseklaasiga.
Katseklaasid proovidega jätsin sademe täielikuks formeerumiseks 20-ks minutiks seisma. Sellel ajal panin valmis neli puhast ja kuiva katseklaasi koos lehtrite ja paberfiltritega.
Järgmisena filtrisin proovid kuivadesse katseklaasidesse. Filtraat tuli täiesti selge ja läbipaistev. Siis määrasin spektrofotomeetril nende optilised tihedused lainepikkuse 280 nm juures. Vastavalt nendele väärtustele leidsin tabelist neis proovides sisalduvad türosiini kontsentratsioonid. Andmed kandsin allolevasse tabelisse:
Optiline tihedus D280
Türosiini kontsentratsioon mg/ml
I katseklaas (0-proov)
0,375
0,059
II katseklaas (1-proov)
0,477
0,076
III katseklaas(2-proov)
0,516
0,081
IV katseklaas (3-proov)
0,569
0,092
Saadud andmete alusel koostasin graafiku: türosiini kontsentratsioon (C) – aeg (t).
Preparaadi proteolüütilise aktiivsuse arvutasin valemi järgi:
kus ΔC – türosiini kontsentratsiooni muutus, mg/ml
Δt – hüdrolüüsi kestus, s
V1 – hüdrolüüsisegu üldmaht, ml
V2 – ensüümilahuse üldmaht, ml
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus, ml
g – proteaasi kaalutis
181 – türosiini molekulmass
2 – TKÄ lahusest tingitud lahjendus
A =
μkat/ml
Järeldus
Saadud tulemus näitab, et 30 oC juures on alkalaasi aktiivsus 9,38 μkat/ml, st 1 sekundi jooksul hüdrolüüsiti 9,38 μmooli peptiidsidemeid.