Invertaasi aktiivsuse määramine (1)

Tallinna Tehnikaülikool
Keemia instituut
Bioorgaanilise keemia õppetool
Laboratoorne töö nr 3.1
Invertaasi aktiivsuse määramine
Tallinn 2013

Teooria

Invertaas süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsidemete hüdrolaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni.
Oligo - või polüsahhariid + vesi –(glükosidaas)-> Monosahhariid + lühem oligo- või polüsahhariid
Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades fruktoosi molekule:
β-D- fruktofuranosiid + H2O –(invertaas)-> β, D-fruktoos + mono - või oligosahhariid
Sahharoos on looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsi produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Sellepärast kasutataksegi invertaasi aktiivsuse määramisel tavaliselt substraadina sahharoosi. Tekkinud produktide kindlakstegemiseks kasutame kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Mis tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimid ta invertaasile mille pH = 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni ning tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Keetmisel taandub kompleksist Cu(II) suhkrute toimel
Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mis keetmise toimel moodustab kompleksi naatriumiga ja tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega jällegi laguneb ning võimaldab Cu(II) ioonidega triloon B kompleksi taastekke.
Töö käik

Valmistasin sobiva kontsentratsiooniga ensüümi lahuse. Uurisin vedelat preparaati, seega lisasin 0,25 ml vedelat preparaati pipetiga gradueeritud katseklaasi, millele lisasin atsetaatpuhvrit (pH=4,8) kuni lahuse maht oli 10 ml. Seega teostasin 40 x lahjenduse. Sulgesin katseklaasi korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks.

Võtsin 50 ml mahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7% sahharoosi lahus atsetaatpuhvris(pH=4,8). Katseklaasile panin korgi peale ning asetasin 10 minutiks vesitermostaati 30±1C˚ juurde.

Võtsin kolm 250 ml koonilist kolbi, kuhu pipeteerisin 10 ml komplekslahust, milleks oli Cu(II)-triloon B kompleks .

Kui substraat saavutas termostaadis vastava temperatuuri, lisasin 1 ml uuritavat töölahust, loksutasin läbi ja võtsin lahusest 0-proovi ehk pipeteerisin samast lahusest koonilisse kolbi 1 ml töölahust ja käivitasin stopperi.

10 ja 20 minuti pärast pipeteeritakse ülejäänud kahte kolbi samuti 1 ml töölahust.

Koonilisi kolbe keetsin elektripliidil püstjahutiga all 10 minutit, aega arvestasin sellest hetkest, kui lahus läks keemia. 10 minuti möödudes lisasin 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti – sellega oli keemine lõppenud.

Kõikidesse kolbidesse tilgutasin pipetiga indikaatorina kolm tilka mureksiidi vesilahust, mis andis kolvis olevale lahusele lillaka tooni.

Viisin läbi lahuse tiitrimise 0,02M CuSo4 -ga kolbi vaikselt loksutades.
Tiitrimise tulemused.

Null lahus - 2ml 0,02M CuSO4 – 1,8mg/ml

10 min lahus – 10,5 ml CuSO4 – 9,1 mg/ml

20 min lahus – 17 ml CuSO4 – 15 mg/ml
Graafiku abiga leidsin neile mahtudele vastavad kontsentratsioonid.
Invertaasi aktiivsuse arvutamine:
A=[(C2 – C1) · V1 · 103 · L] / [T · 180 · V3 · V4]
A10=[(9,1 - 1,8) · 26 · 103·40 ] / [600 · 180 · 1 · 1] = 70,2
A20=[(15 - 1,8) · 26 · 103·40 ] / [1200 · 180 · 1 · 1] = 63,6

• Arvutan erinevuse:
  

(70,2 / 63,6) – 1 · 100% = 10,3%
Analüüs
A10=70,2
A20=63,6
Erinevus kahe aktiivsuse vahel : 10,3%
10,3%-line erinevus tuli sisse tiitrimisel, kuna 0 tiitrisin 0-proovi üle ja samuti oli 20 minuti lahusega väga raske aru saada, millal värv omandas roheka tooni, seega võis minna tiitrimislahust sinna ka liiga palju.